廣東籍漢族患者CD14基因-159C/T位點多態性分析

宋澤慶,陳 敏,陳莉延

(廣東醫學院呼吸疾病研究所,廣東湛江 524001)

廣東籍漢族患者CD14基因-159C/T位點多態性分析

宋澤慶,陳 敏,陳莉延

(廣東醫學院呼吸疾病研究所,廣東湛江 524001)

目的探討廣東籍漢族人CD14基因-159C/T位點多態性和哮喘易感性及對血漿IgE水平的影響。方法正常組和哮喘組各100例。取外周血離心后,用ELISA法測定血漿IgE水平,抽提DNA,用RFLP-PCR方法檢測CD14基因-159C/T位點多態性分布。結果對照組和哮喘組等位基因C、T分布差異有顯著性(χ2=7.61,P＜0.01),C等位基因和哮喘相關(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)兩組基因型(TT、CT、CC)頻率的分布差異亦有顯著意義(χ 2=7.651,P＜0.01),同組內,C等位基因攜帶者血漿IgE水平高于非攜帶者;同一基因型,哮喘組IgE水平高于對照組。結論CD14基因啟動子-159位點多態性和哮喘易感性有關,C等位基因和血漿IgE水平升高相關聯。

哮喘;CD14;多態性;IgE

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0056)

哮喘是一種變應性疾病,是由環境和遺傳因素共同作用引起。遺傳易感性在哮喘的發病中起重要作用,對哮喘進行遺傳學研究是探討其發病機制的一個重要方面。本研究通過對哮喘組和對照組CD14基因-159位點多態性及血漿總IgE水平的檢測,探討CD14基因-159位點多態性在哮喘發病中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

哮喘組:隨機選擇廣東醫學院附屬醫院門診和住院支氣管哮喘患者100例,全部病例均符合中華醫學會呼吸分會2003年制定的《支氣管哮喘防治指南》標準[1]。年齡 14-71歲,男 55例,女 45例;對照組:隨機選擇廣東醫學院附屬醫院門診、保健科健康體檢人員100人,男53,女47例,年齡17-68歲。經檢驗,兩組人群年齡、性別無顯著性差異。上述全部研究對象均為無血緣關系的廣東籍漢族人。對照組均無哮喘病史,無家庭及個人過敏史。

1.2 標本收集及基因組DNA抽提 抽取空腹外周血2 ml,EDTA抗凝,離心后留取血漿約100 μ l,-70℃凍存。余下部分用低滲溶解紅細胞快速抽提法[2](稍作改良)從白細胞中抽提基因組DNA。

1.3 聚合酶鏈反應 引物序列參考文獻[3]:所需引物5-GTGCCAACAGATGAGG TTCAC-3,5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3。PCR反應在 PCR儀上進行,總反應體積為50 μ l,80 ng基因組DNA,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTP,上下游引物各50 ng,1.5 U Taq DNA聚合酶。反應過程:96℃起始變性3分鐘,96℃40秒,56℃40秒,72℃50秒,最后72℃延伸2分鐘,共38個循環。

1.4 限制性片段長度多態性檢測 取PCR產物10 μ l加AvaⅡ6 U,37℃酶切過夜,然后在2%瓊脂糖凝膠,取6 μ l酶切產物在凝膠上上樣電泳,EB染色后紫外燈照射下觀察成像。-159位點的擴增片段長度為497 bp,基因型TT存在AvaⅡ酶切位點,酶切產物為144 bp、353 bp,TT基因型無此酶切位點。而CT基因型酶切產物則為497 bp、144 bp及353 bp。

1.5 酶聯免疫吸附(ELISA) 用ELISA方法檢測血漿IgE,嚴格按說明書操作。

1.6 統計學分析 用基因計數方法計算多態性位點基因型、等位基因頻率,其比較及基因型Hardy-Weinburg平衡吻合度用χ2檢驗;用單因素方差分析(One-way ANOVY)比較正常組和哮喘組血漿IgE水平的差別;不同基因型血漿IgE水平的兩兩比較用q檢驗;同基因型不同組血漿IgE水平的兩兩比較用t檢驗。以上統計學分析使用SAS 8.2軟件進行。

2 結果

2.1 RFLP-PCR檢測結果見圖1

2.2 哮喘與對照組-159位點基因型頻率分布經Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗達到遺傳平衡(表1)。該位點基因型頻率和等位基因頻率比較見表2。

圖1 -159位點PCR產物酶切后電泳結果

表1 -159位點基因型分布的 Hardy-Weinburg平衡

3 討論

CD14基因位于5q13.1其表達的產物是CD14分子,它是一種LPS受體[4],和LPS有較高的親和力。很早人們便發現該基因和變應性及血漿IgE水平相關聯。Baldini等首先報道了CD14啟動子-159位點的CT多態性和變應性有關,他發現該位點TT純合子sCD14的水平高于CT雜合子和TT純合子,而IgE水平確低于后兩者[3]。香港進行的一項對中國兒童的調查發現該位點CC純合子和IgE升高是相關的[5]。在本研究中我們發現,哮喘組和正常組間其基因型的分布差異有顯著性 χ2=7.651,P＜0.01。在哮喘組和對照組中其攜帶的C等位基因是有差異的,前者高于后者,研究證實了C等位基因和哮喘有關,C等位基因攜帶者哮喘的危險性高于T等位基因攜帶者OR(C/T)=1.77。

表2 -159位點對照與哮喘組等位基因頻率及基因型頻率比較

表3 -159位點對照與哮喘組不同基因型血漿IgE水平的比較

哮喘是變應性炎癥,IgE升高是其一個特征。本研究發現在哮喘組中各等位基因型的分布符合Hardy-Weinburg平衡。無論是哮喘組和對照組不同基因型之間其血漿IgE水平差異有顯著性。CC基因型者其血漿IgE明顯高于CT和TT,C等位基因攜帶者有更高的IgE水平,這和以前的研究相同。研究發現CD14啟動子多態性使機體出于一種高變應狀態,即機體的遺傳素質決定了這一規律,雖然從T等位基因到C等位基因的突變使IgE水平升高,但目前尚無資料表明C等位基因和哮喘發病嚴重程度相關。Koppelman的研究證實C等位基因直接影響變應性的表達和變應的嚴重程度,即更高的皮膚試驗陽性率和IgE水平[6]。現已發現CD14啟動子多態性能下調CD14的表達水平,而研究表明CD14和IgE水平呈負相關[7]。CD14能和細菌細胞壁LPS相結合,導致Th0細胞向Th1細胞分化,這種效應可因CD14在濃度的升高而減弱,但具體機制尚未明了[8]。我們推測啟動子該位點T到C的突變很可能改變了啟動子的轉錄效率,使轉錄增加,CD14濃度升高,Th1/Th2平衡向Th2傾斜,炎癥因子IL-13,IL-4,IL-5增多,IgE產生增多,最終導致哮喘易感性的出現。

[1]中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南[J].中華結核和呼吸雜志,2003,26:132.

[2]Lahiri D K,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,1993,31:321

[3]Baldini M,Lohman IC,Halonen M,A Polymorphism*in the 5'flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(5):976.

[4]Goyert S M,Ferrero E,Rettig W J,Yenamandra A K,Obata F,le Beau MM.The CD14monocyte differentiation antIgEn maps to a region encoding growth factors and receptors[J].Science,1998,239:497.

[5]Leung T F,Tang N L,Sung Y M,et alThe C-159T polymorphism in the CD14 promoter is associated with serum total IgE concentration in atopic Chinese children[J].Pediatr Allergy Immunol,2003,14(4):255.

[6]Koppelman G H,Reijmerink N E,Colin Stine OAssociation of a promoter polymorphism of the CD14 gene and atopy[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,63(4):965.

[7]Vercelli D,Baldini M,Martinez F.The monocyte/IgE connection:may polymorphisms in the CD14 gene teach us about IgE regulation[J].Int Arch Allergy Immunol,2001,124:20.

[8]Renckens R,Pater JM,van der Poll T.Plasminogen activator inhibitor typedefi cient mice have enhanced IFN-g response to lipopolysaccharide and staphylococcal enterotoxin B[J].J Immunol,2006,177:8171.

Association of CD14 gene-159C/T polymorphism with asthma in the chinese Han population from Guangdong province

SONGZe-qing,CHEN Min,CHEN Li-yan.(Institute of Respiratory Diseases,Guangdong MedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphism at-159 locus in CD14 gene and asthma and its impact upon plasm IgE level.Methods100 asthma subjects and 100 control subjects were chosen.DNA was isolated from the blood.Polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism(PCR/R FLP)techniques were used to determine-159 locus polymorphism,and plasm IgE level were tested by ELISA.ResultsThe distribution of C andT allelesof-159 are significantly different between the two group,(χ2=7.61,＜0.01),C allele is associated with asthma.(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)The genetype(CC,CT andTT)distributionwasalso significantly different betweentwo groups(χ 2=7.651,P＜0.01);in each group,subjectswith C allele has higherIgE level than subjectswithout C allele,asthma group hashigher IgE level than controlgroupwith same genetype.ConclusionThe-159 polymorphism of CD14 gene may be associatedwith asthma.C allele is associated with higher IgE level.

asthma;CD14;polymorphism;IgE

R562.2+5

A

1007-4287(2010)01-0056-03

2009-03-18)