兩種方法建立口腔念珠菌病動物模型的比較

呂秋菊,馬晟利,代雪麗

(1.黑龍江省佳木斯大學,黑龍江佳木斯 154002;2.黑龍江省醫院,黑龍江 哈爾濱 150036)

兩種方法建立口腔念珠菌病動物模型的比較

呂秋菊1,馬晟利2*,代雪麗1

(1.黑龍江省佳木斯大學,黑龍江佳木斯 154002;2.黑龍江省醫院,黑龍江 哈爾濱 150036)

*通訊作者

白色念珠菌常見于口腔和陰道。白色念珠菌感染好發于嬰兒及老人,特別是口內有義齒基托的老人。但隨著臨床抗生素、抗癌藥物及免疫抑制劑的應用,白色念珠菌病的好發人群已有擴大的趨勢[1]。通過動物模型研究,可以深入了解廣譜抗生素對白色念珠菌的影響。白色念珠菌病的動物模型研究,70年代始獲成功。英國曼徹斯特大學Rusell[2],Jonse[3],Adams等發表了研究結果。80年代初,丹麥阿胡斯皇家牙科學院Fisker[4],Budtz-Jorgensen[5]等也對此進行過研究所使用的方法基本相同,建立模型的成功率為25%。其他國家(瑞典、挪威、美國)亦有零星報道,成功率亦不高。1994年章魁華、王洪君等[6]將建模成功率提高到了100%。但其側重點為白色念珠菌病與癌癥的關系。本研究的目的在于建立口腔粘膜白念感染的動物模型并比較青霉素組與普通組在建模方面的差別。亦致力于提高動物模型建立的成功率,為對白色念珠菌感染的認識及臨床防治提供基礎。

1 材料及方法

1.1 白色念珠菌 臨床株98001傳代菌種,由黑龍江省哈爾濱市藥品檢驗所提供。

1.2 動物 Wistar大鼠,來自于佳木斯大學動物實驗中心,實驗開始時體重200±10 g,6-8周齡。飼料為佳大動物實驗中心提供的標準料塊。分籠飼養,每籠4只。籠具及飲水瓶洗凈,滅菌后使用,每周1次。

1.3 實驗方法 實驗前無菌棉拭子涂抹Wistar大鼠口腔粘膜后做白色念珠菌培養,每周2次,共2周。白色念珠菌培養陽性的大鼠淘汰,共淘汰2只。陰性的大鼠隨機分為以下3組:

1.3.1 對照組 18只,不加任何干預,每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸無菌PBS液涂抹大鼠右頰側口腔粘膜2次。

1.3.2 青霉素組 40只,實驗開始時在大鼠的飲水中加入阿莫西林使其濃度為1%,2周后濃度改為0.1%直至實驗結束。同時每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸濃度為6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右頰側口腔粘膜2次。每周用無菌探針輕劃大鼠右頰側口腔黏膜3下,以不劃破黏膜為準。

1.3.3 普通組 40只,實驗開始時大鼠的飲食不加干預,每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸濃度為6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右頰側口腔粘膜2次。每周用無菌探針輕劃大鼠右頰側口腔黏膜3下,以不劃破黏膜為準。

1.4 細菌檢測 每4周全部動物停止涂白色念珠菌液1周,用15#無菌紙尖在大鼠右頰側患病處反復涂抹10秒鐘,取標本溶于20 μ l稀釋液中,振蕩 1 min使其充分溶解混勻。再依次進行10倍系列稀釋至 10-6,從原液開始選擇 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度,滴種在沙保羅培養基上,37℃培養48小時后,記數菌落。

1.5 病理學檢測 隨機選擇以上3組中建模成功的大鼠各1只,處死并取涂菌處粘膜固定、脫水、包埋和切片。常規HE染色和PAS染色光鏡下觀查以進一步確定建模成功。結果陽性者停止涂白色念珠菌液其它條件不變單獨飼養,間隔1周再做白色念珠菌培養如結果陽性則認定建模成功,結果陰性者繼續涂菌直至建模成功。

2 結果

2.1 全部對照組動物在試驗過程中檢菌皆為陰性,組織學檢查亦皆為陰性。

2.2 實驗組動物檢查結果

2.2.1 臨床觀察可見涂菌側頰粘膜表面白色絨狀斑片,用力擦掉后可見紅色充血糜爛面。與對照組有明顯差異。

2.2.2 將于患處取分泌物涂片,經革蘭氏染色,鏡下見酵母樣孢子。

2.2.3 將于患處取分泌物標本接種于沙保羅培養基上可見乳白色菌落,似奶酪樣。

2.2.4 將于患處取分泌物標本接種于念珠菌顯色培養基上可見淡綠色菌落,似奶酪樣。

2.2.5 組織學檢查 本實驗的80只大鼠在結束實驗時,處死以上四種檢驗均陽性的大鼠取其患處粘膜做病理學檢測,PAS染色可見上皮棘層增生,上皮釘突呈圓形,基底膜部分被炎癥破壞。在粘膜上皮外1/3有菌絲侵入。結果顯示青霉素組和普通培養組白念病在組織學上無明顯差異。

2.2.6 實驗情況 見表1。多變量分析結果表明將各個時間點整體來看青霉素組11周的菌落數與普通組有統計學差異(P＜0.05)。由表1我們可以看出青霉素組菌落數在各個時間點菌落數均高于普通組,且隨著時間的推移,差別越來越大。青霉素組的菌落數增長迅速,普通組菌落數相對緩慢。

表1 青霉素組與普通組11周的菌落數比較(±s)(cfu/ml)

表1 青霉素組與普通組11周的菌落數比較(±s)(cfu/ml)

*多變量分析結果表明青霉素組與普通組比較11周的菌落數有統計學差異,P＜0.05

組別 例數時間(周)1 3 5 7 9 11青霉素組* 40 0.17±0.08 0.96±0.15 2.46±0.15 4.26±0.31 5.84±0.23 6.54±0.43普通組 40 0.08±0.01 0.14±0.05 0.62±0.13 0.84±0.18 1.20±0.12 1.98±0.15

3 討論

本研究的建模成功率為100%,且建模時間比相關文獻要短。其原因可能為:一是青霉素組大鼠飲水中加入廣譜抗生素,給予青霉素水時,采用了不間斷給藥,與其他研究不同(一般第1周給0.1%,第2、3周給0.01%,然后停止),這也可能是提高成功率的原因。二是青霉素組與普通培養組大鼠均每周用探針輕劃粘膜表面,且不劃破為準。既給粘膜表面造成了創傷,又不會因為創傷過大而造成粘膜深部感染。

在上述結論中青霉素組感染白色念珠菌比普通組明顯,這也說明長期應用抗生素往往使得患者體內的微生態環境從一種失調轉變成了另一種失調。口腔微生態平衡是指口腔生態系在一定時間內結構與功能的相對穩定狀態,是口腔微生物和宿主生理功能的高度統一的平衡狀態。當然,這種平衡是動態的平衡。健康口腔是口腔生態平衡的重要表現形式。在健康口腔中其結構和功能以及微生物的組成、分布均處于相對的穩定狀態,并沿著正常的生理性演替次序進行著動態變化。然而,當在外界因素作用下,菌群的波動超過了微群落內部所能承受的能力后,口腔微生態失調隨之發生,某些條件致病菌迅速生長、繁殖,有益菌明顯減少,導致感染性疾病的發生。抗生素、免疫抑制劑等的長期、大量的使用可引起定植抗力明顯減低,外源性特定致病菌入侵機會增大,導致特定感染性的疾病的發生。目前廣譜抗生素的廣泛應用,念珠菌的發病率顯著增加。發病率的上升有兩種原因:一是無針對性地應用“廣譜”導致菌群失調;二是近些年人們對念珠菌病逐漸認識,診斷率提高的緣故。抗生素導致珠菌感染已被公認,人們對失調的機理一直在探討,可能有以下幾個原因:菌群失調、菌體成份、增強菌體毒性、自身毒性作用、降低免疫力。這就要求我們醫務工作者慎用抗生素。

隨著微生態學理論的發展和微生態調節劑的應用,生物拮抗作用逐漸被人們認識。未來的感染性疾病的治療理念不再是殺滅所有的微生物,而是以通過扶持體內的有益菌來拮抗可疑的致病菌,以達到一種動態的,健康的微生態平衡。

[1]Almirante B,Rodriguez D,Park BJ.Epidemiology and Predictors of Mortality in Cases of Candida Bloodstream Infection:Results from Population-Based Sarcdlona,Spain,from 2002 to 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43(4):1829.

[2]Rusell C,Jonse JH.Effects of oral inoculation of candida albicans in tetracycline-treated rats[J].MedMicrobiol,1973,6:275.

[3]Jones JH.Adams D.Expeimentally induced acute oral candidosis in the rat.Brit J Derm,1970,83:670.

[4]Fisker AV.Long ter m oral candidosis in rats.Acta path microbial immunol scand Section B,1982,92:221.

[5]Budtz-Jorgensen E.Denture stomatitis.Anexperimental model inmonkeys.Acta Odontol Scand,1971,9:513.

[6]章魁華,王洪君,傅 嘉,等.口腔粘膜白色念珠菌感染的動物模型研究[J].中華口腔醫學雜志,1994,29(5):266.

1007-4287(2010)02-0289-02

黑龍江省自然科學基金資助項目項目編號:D2007-03

2009-05-28)