丹蒲膠囊對自身免疫性前列腺炎模型IL-2、IL-8、IL-10 的影響

宋豎旗，張亞強，劉詠梅，王文娟，陳玉英，鞠大宏，吳志奎

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069;3.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

近年來，自身免疫因素在慢性前列腺炎(CP)的發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的關(guān)注，國外已應用自身免疫模型進行較多的實驗研究，而國內(nèi)相關(guān)報到較少［1-3］。本課題在建立實驗性自身免疫性前列腺炎模型的基礎上，中藥復方丹蒲膠囊進行干預，采用ELISA法檢測治療前后IL-2、IL-8、IL-10水平變化，從免疫調(diào)節(jié)的角度探討丹蒲膠囊治療慢性前列腺炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠共60只，250g～300g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物中心(動物合格證號SCXK-(軍)2002-001)。大鼠購進后常規(guī)飼養(yǎng)觀察1周，無異常后進行實驗，實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求。

1.1.2 藥品、試劑 丹蒲膠囊(由丹參、蒲公英、赤芍、澤蘭等10余味中藥組成)，中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(批號京藥制字Z20063198，規(guī)格0.4 g×60粒);對照藥物:前列泰片(由益母草、萹蓄、紅花、油菜蜂花粉等組成)，甘肅河西制藥廠生產(chǎn)(批號Z10980063，規(guī)格0.44 g×60粒)。完全弗氏佐劑(批號F5881)和不完全弗氏佐劑(批號F5506)，美國Sigma公司;IL-8 ELISA試劑盒(美國R＆D公司，批號E0080r)、IL-2 ELISA試劑盒(美國 R＆D公司，批號 E0073r)、IL-10 ELISA試劑盒(美國R＆D公司，批號E0056r);DU-600紫外分光光度計(BECKMAN公司);高速冷凍離心機(BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 先取雄性Wistar大鼠中的10只斷脊處死，仔細剝?nèi)∏傲邢俳M織稱重，冷鹽水洗凈，加入含等重的預先高溫滅菌的0.5%TritonX-100生理鹽水溶液，勻漿，12000 r/min離心30 min，取上清液，用紫外法按公式測定蛋白含量。

1.2.2 分組與模型復制 取60只雄性Wistar大鼠，按隨機數(shù)字表法分為6組，即丹蒲膠囊高、中、低劑量組、前列泰組、模型組和正常組，每組10只。制作模型:測定蛋白含量后，以生理鹽水稀釋至40 g/L，再以完全弗氏佐劑倍量乳化。除正常組大鼠外，其余各組大鼠皮下多點注射乳化后的抗原液1ml造模［4］。

1.2.3 給藥方法 造模24 h后開始灌胃給藥。給藥劑量參照實驗動物與人體重等效劑量換算公式換算［5］。丹蒲膠囊高劑量組給藥1.37 g/(kg·d)，丹蒲膠囊中劑量組給藥0.91g/(kg·d)，丹蒲膠囊低劑量組給藥0.46g/(kg·d)，分別相當于臨床用量的15、10、5倍;前列泰組為2.2 g/(kg·d)，相當于臨床用量的15倍;模型組、正常組分別給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃1次，給藥10周。

1.2.4 檢測指標及方法 給藥10周后，股動脈采血(儲存于－80℃冰箱中備用)，處死動物。細心剝離前列腺組織固定、脫水、包埋，HE染色，光鏡下觀察各組動物前列腺組織形態(tài)學變化。ELISA法檢測大鼠前列腺組織及外周血IL-2、IL-8、IL-10水平，按試劑盒說明書在專業(yè)實驗人員指導下進行。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS11.5軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，多組均數(shù)比較用單因素方差分析法。經(jīng)方差分析，組間總體差異有顯著性意義，且滿足正態(tài)性和方差齊性時，兩兩比較用Student-Newman-Keuls-Test法;方差不齊選用Dunnett's法。結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，標準水平取α=0.05，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組病理組織學改變

正常組:前列腺組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列及分布正常，間質(zhì)內(nèi)未見明顯炎細胞浸潤(見圖1F)。模型組:前列腺腺體遭到破壞，部分腺腔內(nèi)有分泌物。管腔內(nèi)上皮組織完全壞死、剝脫和消失，間質(zhì)及腺體充滿大量彌散的淋巴細胞、單核細胞，間質(zhì)組織明顯變寬(見圖1E)。丹蒲膠囊高劑量組:前列腺大部分腺泡結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)內(nèi)炎細胞浸潤不明顯，部分腺腔內(nèi)有分泌物，無間質(zhì)水腫，與模型組比較，間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞明顯減少(見圖1A)。丹蒲膠囊中劑量組:前列腺組織結(jié)構(gòu)清楚，部分腺腔內(nèi)有分泌物，管腔內(nèi)可見少量單核上皮，與模型組比較，間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞減少，可見散在淋巴球(見圖1B)。丹蒲膠囊低劑量組:前列腺腺泡腔內(nèi)有少量分泌物，間質(zhì)可見分布不均的淋巴細胞、單核細胞浸潤，與模型組比較，間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞減少(見圖1C)。前列泰片組:前列腺組織腺體排列及分布基本正常，部分腺腔內(nèi)有分泌物，與模型組比較，間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞減少，間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細胞浸潤(見圖1D)。

圖1 各組光鏡下病理學改變

2.2 各組前列腺組織及血清IL-8變化

表1顯示，與正常組比較，模型組前列腺組織和血清IL-8水平明顯增高(P<0.05);丹蒲膠囊高劑量組、前列泰組前列腺組織和血清IL-8水平均明顯降低，與模型組比較，差異有顯著性意義(P均<0.05);丹蒲膠囊中、低劑量組前列腺組織IL-8水平亦見降低，但與模型組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。

表1丹蒲膠囊對前列腺組織及血清IL-8水平的影響(±s)

表1丹蒲膠囊對前列腺組織及血清IL-8水平的影響(±s)

注:與正常組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與模型組比較:★P<0.05，★★P<0.01

組別 組織IL-8(pg/mg) 血清IL-8(pg/ml)正 常 組60.05±14.98 87.77±20.76丹蒲膠囊高劑量組 78.41±22.88★★ 110.39±22.03★★丹蒲膠囊中劑量組 98.40±14.35 125.27±43.56丹蒲膠囊低劑量組 110.56±40.78 137.53±57.29前 列 泰 組 82.30±24.93★★ 110.38±34.27★★模 型 組 131.42±49.29△△ 178.08±42.70△△

2.3 各組前列腺組織及血清IL-2變化

表2顯示，與正常組比較，模型組前列腺組織IL-2水平明顯增高(P<0.01);與模型組比較，丹蒲膠囊高劑量組、前列泰組前列腺組織IL-2水平明顯降低(P均<0.05);與正常組比較，模型組外周血IL-2水平明顯增高(P<0.01);與模型組比較，丹蒲膠囊高、中劑量組、前列泰組前列腺組織IL-2水平明顯降低(P均<0.05)。

表2丹蒲膠囊對前列腺組織及血清IL-2的影響(±s)

表2丹蒲膠囊對前列腺組織及血清IL-2的影響(±s)

注:與正常組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與模型組比較:★P<0.05，★★P<0.01

組別 組織IL-2(pg/mg) 血清IL-2(pg/ml)正 常 組77.47±20.86 88.12± 6.43丹蒲膠囊高劑量組 96.28±29.44★ 96.87±17.13★★丹蒲膠囊中劑量組 125.09±37.51 103.51±23.03★★丹蒲膠囊低劑量組 106.74±14.69 120.05±18.68前 列 泰 組 90.35±26.04★ 99.71±19.30★★模 型 組 140.11±61.41△△ 143.83±30.21△△

2.4 各組前列腺組織及血清IL-10變化

表3顯示，與正常組比較，模型組前列腺組織IL-10水平明顯增高(P<0.01);與模型組比較，丹蒲膠囊高劑量組、前列泰組前列腺組織IL-10水平明顯降低(P均<0.05);與正常組比較，模型組外周血IL-10水平明顯增高(P<0.01);與模型組比較，丹蒲膠囊各劑量組、前列泰組前列腺組織IL-10水平明顯降低(P均<0.05)。

表3丹蒲膠囊對IL-10水平的影響(±s)

表3丹蒲膠囊對IL-10水平的影響(±s)

注:與正常組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與模型組比較:★P<0.05，★★P<0.01

組別 組織IL-10(pg/mg) 血清IL-10(pg/ml)正 常 組63.07±14.44 79.10±17.66丹蒲膠囊高劑量組 77.84±16.50★★ 92.06±13.62★丹蒲膠囊中劑量組 95.98±21.59 93.83±25.46★丹蒲膠囊低劑量組 94.31±13.40 84.10±37.60★★前 列 泰 組 77.94±16.12★★ 92.28±22.70★模 型 組 116.26±28.00△△ 127.37±25.28△△

3 討論

慢性前列腺炎是中青年男性的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率高達2.2% ～9.7%［6］，該病病因復雜，病程較長且容易復發(fā)，嚴重危害患者的身心健康。

隨著分子生物學、免疫學的發(fā)展，免疫因素在CP發(fā)病中的作用越來越受到重視，這一過程是以細胞因子為介導發(fā)生的［7］，抗炎性細胞因子、促炎性細胞因子和調(diào)節(jié)性細胞因子之間動態(tài)平衡決定該病炎癥反應的程度及轉(zhuǎn)歸［8］。研究已發(fā)現(xiàn)，慢性前列腺炎患者的前列腺液或精漿中均發(fā)生過IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 等細胞因子的變化［9、10］。

丹蒲膠囊是中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院劉猷枋教授根據(jù)CP患者的臨床癥狀、體征，針對其瘀阻、濕熱之病機［11］組方而成。方中丹參、澤蘭、赤芍、桃仁、紅花諸藥重在活血化瘀、導滯散結(jié)而生新，共為君藥;敗醬草、蒲公英、白芷清熱解毒，消腫散瘀而為臣藥;沒藥活血行氣通絡、王不留行通利血脈，共為佐藥;川楝子行氣止痛、石葦清利濕熱，同為使藥，諸藥合用，活血行氣止痛、清利濕熱。臨床應用40余年發(fā)現(xiàn)，丹蒲膠囊能明顯改善慢性前列腺炎患者臨床癥狀，降低前列腺液白細胞數(shù)，提高前列腺液卵磷脂小體密度，升高前列腺液Zn含量，對慢性前列腺炎患者前列腺液IL-2、IL-6水平有顯著降低作用，推測丹蒲膠囊具有免疫調(diào)節(jié)作用。

基于以上認識，本研究在建立自身免疫性前列腺炎大鼠模型的基礎上，選取IL-8(促炎性細胞因子)、IL-2(調(diào)節(jié)性細胞因子)、IL-10(抗炎性細胞因子)作為觀察指標，通過觀察丹蒲膠囊對以上因子的影響，探討丹蒲膠囊治療作用的分子機制。

研究結(jié)果:①采用前列腺蛋白結(jié)合免疫佐劑方法建立免疫性前列腺炎大鼠模型。光鏡下可見，模型組前列腺腺體遭到破壞，間質(zhì)及腺體充滿大量彌散的淋巴細胞、單核細胞，符合前列腺炎的病理改變，表明模型復制成功。給藥后發(fā)現(xiàn)，丹蒲膠囊各劑量組均能明顯減輕或消除模型大鼠的前列腺組織炎癥，為丹蒲膠囊的臨床療效提供了病理組織學依據(jù)。②ELISA結(jié)果:與正常對照組比較，模型組動物血清及前列腺組織中IL-2、IL-8、IL-10等因子水平均明顯升高，說明模型動物存在自身免疫后的炎性反應;與模型組比較，丹蒲膠囊各劑量組血清及前列腺組織炎性因子水平出現(xiàn)不同程度的下降，且以丹蒲膠囊大劑量組為優(yōu)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。值得注意的是，課題組檢測到的抗炎性細胞因子IL-10在給藥10周后，其水平明顯低于模型組。這是因為在炎癥的慢性階段，抗炎性細胞因子IL-10水平增高來對抗促炎性細胞因子的表達［7］。而丹蒲膠囊給藥后，前列腺組織的炎癥損傷得以修復，IL-10水平逐漸恢復至正常水平。

綜上可知，自身免疫因素參與了慢性前列腺炎的發(fā)病過程，在這個過程中，細胞因子間的動態(tài)平衡受到破壞。中藥丹蒲膠囊干預后，這個平衡得以恢復。該研究從免疫調(diào)節(jié)的角度揭示了中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎的分子機制。

［1］Vykhovanets EV，Shukla S，MacLennan GT，et al.Il-1 betainduced post-transition effectofNF-kappaB providestimedependent wave of signals for initial phase of intrapostatic inflammation［J］.Prostate，2009，69(6):633-643.

［2］Bagavant H，Tung KS.Failure of CD25+T cells from lupus-prone mice to suppress lupus glomerulonephritis and sialoadenitis［J］.J Immunol，2005，175(2):944-950.

［3］Rivero V，Canmaud C，Riera CM.Prostatein or steroid binding protein(PSBP)induces experimental autoimmune prostatitis(EAP)in NOD mice［J］.Clin Immunol，2002，105(2):176-184.

［4］張亞強，王炎，李敏，等.大鼠前列腺組織抗原蛋白誘導自身免疫性前列腺炎模型的建立［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2008，14(6):584-587.

［5］何誠.實驗動物學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2006.283.

［6 ］Krieger JN，Lee SW，Jeon J，et al.Epidemiology of prostatitis［J］.Int J Antimicrob Agents，2008，31 Suppl 1:S85-90.

［7］郭應祿，李宏軍.前列腺炎［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2007.346.

［8 ］Jang TL，Schaeffer AJ.The role of cytokines in prostatitis［J］.World J Urol，2003，21(2):95-99.

［9 ］Stancik I，Plas E，Juza J，et al.Effect of antibiotic therapy on interleukin-6 in fresh semen and postmasturbation urine samples of patients with chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome［J］.Urology，2008，72(2):336-339.

［10］侯四川，馮元法，王春玲.慢性前列腺炎病人前列腺液中IL-2、IL-1β、IL-8、TNF-α 和 PGE2的變化及意義［J］. 青島大學醫(yī)學院學報，2007，43(6):497-499.

［11］劉猷枋，張亞強.中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科學［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2007.229-230.