靜安口服液對小兒多發性抽動癥模型大鼠抽動行為及腦組織、血漿5-羥色胺含量的影響

隆紅艷，張 驃，談瑄忠

(1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210046;2.南京市中醫院，江蘇南京 210001)

小兒多發性抽動癥是一種兒童期起病、通常伴有運動和行為異常的慢性神經精神障礙性疾病。1885年法國醫生Gille de la tourette首先報道了9例具有本病臨床特征的患兒，本病又稱為Tourette綜合征(Tourette Syndrome，TS)［1］。最新流行病學研究資料表明，本病的發病率在1.0% ～4%之間，且有逐年增高的趨勢，發病年齡高峰在4歲～12歲之間，男女性別比為3～4∶1。本病是一個具有復雜病因和多樣表型的臨床綜合征，其病因和發病機制目前仍不十分清楚，一般認為發病與遺傳和神經遞質系統的異常有關。單胺類神經遞質在中樞神經遞質系統中扮演著非常重要的角色，5-羥色胺(5-HT)是僅次于多巴胺的單胺類神經遞質，作為中樞神經系統功能調節的重要神經遞質，參與多種生理功能，并與情緒和沖動控制等密切相關，因此近年來有關Tourette綜合征的研究，5-HT也是研究熱點之一［2］。

靜安口服液具有滋腎平肝、息風化痰功效［3、4］，6年來經治200余例患者，已獲得較為顯著的療效。本實驗將觀察其對Tourette綜合征模型大鼠抽動行為的改善、腦組織及血漿5-HT含量的影響及其相互關系，以期進一步闡明Tourette綜合征的發病機制及靜安口服液的效應機理。

1 材料

1.1 藥品與試劑

靜安口服液由南京市中醫院制劑室提供，每毫升含生藥 1.1g，批號 081024。DOI［選擇性 5-HT(2A/2C)受體激動劑 1-(2，5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane］由 Sigma公司生產，上海博蘊生物公司提供。硫必利片由江蘇恩華藥業集團有限公司生產，批號20070502。

1.2 實驗儀器

高效液相儀(HPLC):日本島津L-ECD-6A型;臺式冰凍離心機:美國BECKMAN公司GS-15R型。

2 方法

2.1 TS大鼠模型及測試方法的建立、靜安口服液對抽動行為的影響［5、6］

雄性SD大鼠40只，200g±10g，分籠飼養，常規飲食，隨機分為空白組、模型組、靜安組、硫必利組。模型組、靜安組、硫必利組腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI，誘導大鼠抽動模型，空白組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。靜安組、硫必利組同時分別灌服靜安口服液、硫必利，空白組、模型組灌服同劑量生理鹽水。用藥后大鼠抽動行為可持續2h～3h，連續給藥10d左右，大鼠產生較持久的抽動行為。

大鼠腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI后出現頭部抽動、聳肩及口腔運動、理毛、舔食前爪等刻板動作，其中頭部抽動明顯且容易分辨，作為該模型誘導成功的觀察指標。

大鼠的抽動及刻板運動測試:治療20d后將各組大鼠逐個放入觀察籠內，適應5min后，按文獻［1］TS動物模型中對抽動、刻板行為的評分方法并加以改良，在最后1次給藥后1h，進行雙盲觀察1h，5min記錄1次，并記錄總分。大鼠的抽動及刻板運動評分標準如下:0分:無抽動或刻板運動;1分:聳肩及口腔運動、理毛、舔食前爪等刻板動作或旋轉行為;2分:頭和頸部上下運動過多;3分:頭、頸部上下運動過多加旋轉行為;4分:頭向側擺合并頭和頸部的上下運動過多。

2.2 5-HT的測定

2.2.1 樣本采集 腦組織:第20天灌胃、腹腔注射后，夜間禁食不禁水，第21天各組大鼠脫頸處死，冰碟上迅速取出腦組織，稱重后放入－80℃冰箱保存。血漿:第20天灌胃、腹腔注射后，夜間禁食不禁水，第21天眼眶取血4ml～5ml，分別入EDTA抗凝管，冷凍離心(3000r/min，10min)，取血漿上清液－80℃冰箱保存。

2.2.2 樣本處理與測試 腦組織樣本處理:取大鼠腦組織0.7g，加入0.5 ml 10%HClO4溶液勻漿沉淀蛋白，轉移至5 ml的具塞試管中，用三蒸水定容至刻度。取上述樣品液1ml 12000r/min離心15min，取上清液490μl于PE 管中，加入10μl 10μg/ml內標溶液，渦旋30s，20μl注入色譜分析儀分析。血漿樣本處理:取300μl大鼠血，加入50μl 30% 三氯乙酸，混勻沉淀蛋白，12000r/min離心10min，取上清液100μl于PE管中，20μl注入色譜分析儀分析。色譜條件:流動相為檸檬酸:35mmol/L，磷酸二氫鈉:45mmol/L，庚烷磺酸鈉:2mmol/L，EDTA:0.25mmol/L，乙腈:5.5%(v/v)，NaOH 調 pH=4.15;流速為1.0ml/min;柱溫為30℃;色譜柱為Diamonsi C18(150×4.6mm，5μm)不銹鋼柱。

3 結果

與空白組相比，模型組抽動及刻板運動顯著性增多(P<0.01)，靜安組與硫必利組較模型組的抽動及刻板動作明顯減少(P<0.05)，提示應用DOI成功誘導了大鼠抽動模型，類似Tourette綜合征的臨床表現，表明靜安口服液明顯減少抽動和刻板動作次數，具有良好的對抗抽動及刻板行為作用。

表1 靜安口服液對TS模型大鼠抽動或刻板運動評分的影響(n=10，±s)

表1 靜安口服液對TS模型大鼠抽動或刻板運動評分的影響(n=10，±s)

注:與空白組比較:**P<0.01;與模型組比較:△P<0.05

組別 劑量(g/100g)抽動及刻板運動空 白 組 —6.70±3.65模 型 組 — 18.20±2.97 靜 安 組 1.1 12.30 ±3.62△硫 必 利 組 0.0025 14.80±3.08△

模型組大鼠腦組織中5-HT含量較空白組明顯升高(P<0.01)，治療組(靜安組與硫必利組)腦5-HT含量較模型組明顯降低(P<0.01)，靜安組與硫必利組有顯著性差異(P<0.01)，說明抽動癥模型建立成功;靜安口服液和硫必利可能通過降低腦組織5-HT含量，從而發揮治療TS的作用;靜安口服液比硫必利更好地降低了腦組織中5-HT的含量。

表2 靜安口服液對TS模型大鼠腦組織5-HT的影響(n=10，±s)

表2 靜安口服液對TS模型大鼠腦組織5-HT的影響(n=10，±s)

注:與模型組比較:△△P<0.01;與硫必利組比較:##P<0.01

組別 劑量(g/100g) 5-HT(ng/g)空 白 組 — 315.73±95.48△△模 型 組 — 815.12±141.60靜 安 組 1.1 320.95± 60.58△△##硫 必 利 組 0.0025 503.92±66.41△△

與空白組相比，模型組血漿5－HT水平無明顯變化;治療組(靜安組和硫必利組)血漿5-HT水平較模型組顯著降低(P<0.05)，靜安組和硫必利組相比無顯著性差異，提示靜安口服液具有良好的降低血漿5-HT含量的作用。

表3 靜安口服液對TS模型大鼠血漿5-HT的影響(n=10，±s)

表3 靜安口服液對TS模型大鼠血漿5-HT的影響(n=10，±s)

注:與模型組比較:△P<0.05

組別 劑量(g/100g) 5-HT(ng/ml)空 白 組 —197.17±104.23模 型 組 — 259.20±129.71靜 安 組 1.1 128.71±66.93△硫 必 利 組 0.0025 121.16±48.69△

4 討論

中樞5-HT神經纖維從中縫核發出，廣泛投射到腦內的各個區域，如大腦皮質、紋狀體、黑質和海馬等，是僅次于多巴胺的單胺類神經遞質，它通過釋放神經遞質5-HT與神經細胞膜上相應的受體結合而發揮作用。在中樞神經系統，5-HT能神經元對不同腦區神經元活動發揮興奮或抑制的調節作用，主要取決于與之相結合的受體類型和分布位置。5-HT受體可分為5-HT1～5-HT7七大種亞型，每一種還可以被進一步分型，其作用極其廣泛復雜，有的亞型生理功能尚不清楚。一般而言，中樞神經細胞受體興奮性增強后，可促使更多的神經遞質與之結合，從而使游離的神經遞質水平降低，如多巴胺等的代謝過程即如此。但本實驗結果顯示，運用選擇性5-HT(2A/2C)受體激動劑后，模型組腦組織游離5-HT水平明顯升高。這看似矛盾的結果，可能與5-HT受體功能的復雜性有關。比如大腦皮層分布有大多數的5-HT受體亞型，激活皮層突觸前的5-HT1A或5-HT1B自身受體，可使皮層5-HT的水平明顯降低，而激活突觸后的受體是加強或抑制皮層神經細胞的活動，則取決于突觸后受體亞型的構成情況。Bobula等報道［7］，選擇性 5-HT(2A/2C)受體激動劑DOI可通過降低大鼠前額皮層的神經細胞靜息K+的電導性，使細胞膜去極化，從而增強細胞的興奮性和動作電位的發放頻率，加強神經細胞的活動，使皮層5-HT的水平明顯升高。此外，很多5-HT受體亞型都有易化5-HT等神經遞質釋放的作用。如有實驗表明，海馬中5-HT3受體亞型對5-HT遞質的釋放具有正反饋的作用［8、9］，關于其他部位5-HT2受體亞型是否存在此機制，尚需進一步闡明。總之，本實驗觀察到的運用選擇性5-HT(2A/2C)受體激動劑后腦組織游離5-HT水升高現象，可能與其刺激突觸后受體亞型、降低神經細胞靜息K+的電導性或激活易化5-HT遞質釋放功能等因素有關。

本實驗應用DOI(選擇性5-HT(2A/2C)受體激動劑)成功誘導了大鼠抽動模型，類似Tourette綜合征的臨床表現，說明5-HT活動異常有可能是Tourette綜合征的發病原因之一。實驗結果表明，5-HT分泌過多導致抽動發生，靜安口服液明顯減少抽動和刻板動作次數，具有良好的對抗抽動及刻板行為作用;靜安口服液明顯降低腦組織與外周血中5-HT水平，其降低模型大鼠腦組織中5-HT的作用較硫必利明顯，降低模型大鼠血漿5-HT的作用與硫必利相當。推測其作用機理主要是拮抗5-HT受體、抑制5-HT的異常釋放，從而降低突觸前5-HT神經元的過度支配;另外，盡管硫必利等治療Tourette綜合征常用藥能抑制抽動癥狀，且起效較快，但是由于其具有嗜睡、肝功能損傷、肌肉強直及運動失調等副作用，不適合長期應用。相比之下，靜安口服液具有副作用小、療效確實而持久，并同時能調節患兒身體陰陽平衡和臟腑功能、全面改善患兒身體狀況的獨特優勢，因而頗具發展潛質［4］。

有關中樞與外周5-HT含量變化相互關系的研究不多，本實驗觀察到二者變化基本一致，即中樞與外周皆有模型組含量升高(血漿中呈增高趨勢)、經治療后其含量明顯降低且成正相關現象。但關于腦組織與外周血5-HT含量的變化與Tourette綜合征發生之間的關系，以及靜安口服液在此關系中的影響作用，則需進一步深入研究。

［1］劉智勝.小兒多發性抽動癥［M］.北京:人民衛生出版社，2002:4-15.

［2］姚陽，麻宏偉.Tourette綜合征神經生物學研究進展［J］.國外醫學兒科學分冊，2005，32(3):137-140.

［3］張驃.小兒多發性抽動癥中醫證治特點及其研究述略［J］.江蘇中醫藥，2004，25(9):1-3.

［4］張驃，孔群，林節，等.靜安口服液為主治療小兒多發性抽動癥的臨床研究［J］.南京中醫藥大學學報，2008，24(3):156-159.

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