補腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響

李淑云，羅頌平

(廣州中醫藥大學 第一附屬醫院，廣東 廣州 510000)

補腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響

李淑云，羅頌平△

(廣州中醫藥大學 第一附屬醫院，廣東 廣州 510000)

目的:探討補腎法對腎虛排卵抑制模型大鼠妊娠的內分泌激素、臟器濕重及妊娠率的影響。方法:采用羥基脲灌胃造腎虛排卵抑制大鼠模型，造模成功后予以羅氏促排卵湯和/或針灸補腎法治療，治療后的第6天與雄鼠合籠，合籠后繼續治療10d取出雄鼠，1周后觀察大鼠內分泌激素、臟器濕重及妊娠率的情況。結果:治療后各治療組大鼠內分泌激素及臟器濕重及妊娠率均有不同程度的增加。結論:補腎法包括補腎復方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進行治療，可以有效增加大鼠的妊娠率，但對大鼠其他臟器濕重、內分泌指標的影響無統計學意義。

補腎法;腎虛排卵抑制模型大鼠;內分泌激素、臟器濕重及妊娠率

本研究以SD大鼠腎虛排卵抑制模型為研究工具，以羅氏促排卵湯和/或針灸補腎法為施加因素，研究補腎法對腎虛排卵抑制模型的促排卵作用。通過觀察與雄鼠合籠各組大鼠的血清性激素、子宮和卵巢等臟器的濕重、妊娠率，探討補腎法對排卵障礙性模型大鼠的妊娠影響，為臨床治療提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

10～12周齡、體重220g～250g左右的 SPF級SD大鼠，來源于廣州中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 藥物、試劑

1.2.1 羥基脲 魯衛藥準字(2000)第024014號，片劑0.5/片，山東齊魯興華制藥廠生產，批號20010407。

1.2.2 羅氏促排卵湯方的水提濃縮液 羅氏促排卵湯方組方:菟絲子20g，制巴戟15g，淫羊藿10g，當歸 10g，黨參 20g，炙甘草 6g，熟附子 6g(先煎)，熟地15g，枸杞子20g，加工制作后每毫升含生藥量為1.55g/ml。

1.2.3 試劑 E2、P、HCG放免試劑盒，由北京科美東雅生物技術有限公司提供。

1.3 分組

隨機將SPF級成熟雌性SD大鼠分為 A組(腎虛排卵抑制模型組)、B組(造模加中藥組)、C組(造模加針刺組)、D組(造模加針刺加中藥組)、E組(正常對照組)5組。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 成熟雌性大鼠根據陰道細胞圖片確定，并在卵泡早期給予羥基脲灌胃，用生理鹽水配制，300mg/kg/d，灌胃第 19天加大藥量為500mg/kg/d，固定飼料統一喂養，自由飲水，隔日晨陰道涂片。

1.4.2 造模成功標準 隔日進行陰道脫落細胞涂片檢查，持續僅觀察到核上皮或局化上皮，無周期性變化者;病理改變提示為排卵抑制;觀察大鼠的表現:出現拱背，蜷縮少動、反應較為遲鈍、體毛疏松不光亮、肌肉松弛、進食量減少等腎虛表現，符合腎虛-排卵抑制的證候與病理特征，則造模成功。

1.5 藥物和/或針灸干預

根據分組情況分別給予干預。中藥:大鼠藥物的用量根據大鼠體重換算公式計算而得。公式:公斤體重劑量(mg/kg)dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3(R代表比重系數，B代表大鼠，A代表人)。針灸取穴:取雙側子宮穴、雙腎俞穴、中極穴、關元穴，根據不同部位的穴位進針后接電針儀，選用波形、疏密波;電量 15Hz，大小 0.5，加電 10min，將大鼠放入大鼠固定器中，10min后取針。

1.6 采血與取材

藥物和/或針灸干預的第6天，將各組大鼠與雄鼠合籠，合籠后繼續治療10d后取出雄鼠，各組大鼠繼續自然喂養7d處死，眼眶后靜脈取血，保留血清待測激素水平。取血后在無菌條件下處死、解剖，剪取垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮，剔除脂肪，各臟器分別用電子分析天平稱濕重。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數和胚胎直徑。

1.7 觀測指標

一般情況如形態、毛色、活動、納食、大便等。解剖后肉眼觀察垂體、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮，電子分析天平稱濕重。測定血清促卵泡成熟激素雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)、β 絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)定量。妊娠大鼠記錄妊娠胚胎數、胚胎直徑。

1.8 統計學方法

采用SPSS 11.5統計學分析軟件進行數據處理，測定結果以±s表示，采用單因素方差分析，2組間均數比較采用t檢驗，以P小于0.05作為統計學差異的標準。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s，n=12，g)

表1 各組大鼠造模前后體重變化(±s，n=12，g)

注:單因素方差分析，同組造模前后比較:*P<0.05， P<0.01;組間比較:同A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 造模前體重 造模后體重 造模前后體重差A組 220.5±13.66 230.8±36.69△△ 10.3±9.54△△ B組 213.3±12.95 240.0±14.12 30.7±6.13 C組 219.2±10.02 251.9±16.32 32.8±4.32 D 組 213.4± 7.44 232.9±27.25△# 19.4±9.70△ E組 217.0± 8.70 263.1±14.89## 46.1±3.30

2.2 觀察體重變化情況

造模成功后進行治療并合籠，觀察治療前后體重變化。

表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s，g)

表2 各組大鼠治療前與治療并合籠后體重變化(±s，g)

注:因素方差分析，同組治療前后比較:*P<0.05， P<0.01;治療前和治療后組間比較:同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 治療前體重 治療后體重 治療前后體重差A組 4 235.5±19.000△△ 268.2±43.980△△ 32.7±26.862 B 組 4 254.5±15.780 335.5±30.610 81.0±32.270 C組 3 251.3± 8.505 299.3±20.232△ 48.0±10.985 D組 4 230.3±18.892△△ 292.3±26.424△△ 62.0± 8.524 E組 6 272.8±19.763 355.2±18.670 82.3±11.498

2.3 各組大鼠臟器濕重情況

2.4 各組大鼠 E2、P、β-HCG

表3 各組大鼠臟器濕重(±s，g)

表3 各組大鼠臟器濕重(±s，g)

注:單因素方差分析，治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01;C與 D比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別 n 子宮 卵巢 腎臟 腎上腺 脾臟 腦垂體A組 4 3.116±4.036 0.147±0.042 1.883±0.330 0.068±0.0098 0.863±0.263 0.0097±0.0022 B組 4 6.840±5.700 0.148±0.042 2.084±0.298 0.077±0.0187 0.839±0.127 0.0100±0.0027 C組 3 8.346±3.870#△ 0.159±0.037 2.083±0.122 0.084±0.0171 1.092±0.227 0.0066±0.0089 D組 4 3.516±3.166▲ 0.113±0.018 1.875±0.085 0.078±0.0093 0.849±0.206 0.0080±0.0008 E組 6 6.398±2.440 0.155±0.028 1.981±0.119 0.065±0.0168 0.803±0.098 0.0077±0.0027

表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

表4 各組大鼠E2、P、β-HCG(±s)

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2.5 各組大鼠妊娠情況

表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

表5 各組大鼠妊娠情況(±s)

注:因素方差分析，治療后組間比較:同 A組比較:#P<0.05，##P<0.01;同 E組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 n 受孕例數 胚胎大小(cm) 胚胎數(個) 妊娠率(%)A 組 4 2 0.375±0.479 6.25±7.228△50 B組 4 3 0.800±0.606 8.25±5.560 75 C組 3 3 0.900±0.115 10.50±1.528 100 D組 4 3 0.625±0.479 8.25±5.737 75 E組 6 6 0.833±0.151 14.50±2.074#100

3 討論與結論

3.1 羥基脲造模方法的選擇與使用

羥基脲(Hydroxyurea，簡稱 HU)，又稱羥基脲素，分子式為CH4N2O2，為白色或無色針狀結晶，無臭，味微澀，微溶于水及醇，固體干燥狀態較穩定，遇水不穩定，血漿最高血藥濃度(Tmax)為1h～2h，6h從血中消失，可透過血-腦脊液屏障，20%在肝內代謝，80%由尿排出。羥基脲是一種核苷酸還原酶抑制劑，在核苷酸代謝過程中發揮中心作用，是一種別構酶，是惟一受到高度調控的酶系統。它將二磷酸核苷酸轉化為于脫氧核糖核苷酸，參與DNA合成過程中所有前體物的凈合成，該酶活力直接影響DNA合成及腫瘤細胞增殖。

現代科學技術對腎虛的研究認為，下丘腦細胞損害和功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎，因其損害引起下丘腦-垂體-腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸不同程度的功能紊亂，同時代謝器官、免疫系統也出現功能和病理的改變，故而腎虛是有物質基礎的，是“腎”的功能衰退而引起機體一系列病理變化，包括免疫功能低下、內分泌功能紊亂和三大物質代謝障礙等［1］。因此，用羥基脲造成的腎虛動物模型，是在中醫理論指導下建立的具有人類證候表現的動物實驗對象，該模型已被廣泛認可并使用［2～5］。對于腎陽虛證動物模型造模方法，陳英華等進行了綜述研究，認為腎陽虛動物模型主要有兩大內容:一是腎陽虛證病理動物模型，主要有腎上腺皮質功能受抑制模型、甲狀腺功能受抑制模型、性腺功能受抑制模型、DNA合成抑制腎陽虛模型等;二是腎陽虛證病因動物模型，主要有恐傷腎腎虛動物模型、老年腎虛動物模型、房勞墮胎傷腎腎虛動物模型、先天腎虛動物模型等［6］。

本實驗選用羥基脲建立成熟雌性大鼠腎虛排卵抑制模型(給予羥基脲300mg/kg/d，連續18d，第19天開始再給予羥基脲500mg/kg/d，連續11d)。卵巢病理切片卵泡計數結果顯示，造模大鼠卵巢組織中次級生長卵泡與成熟卵泡的比例明顯減少，而以原始卵泡和初級生長卵泡為主，提示造模成功。

3.2 羅氏促排卵湯藥物作用和分析

中醫學認為腎主生殖，腎為先天之本，元氣之根，主藏精氣，在機體的整個生命活動中起著主導作用。腎精包括先天之精與后天之精，為生長發育與生殖之源，故在狹義上又稱為“生殖之精”。腎精是婦女月經與胎孕的物質基礎?，F代中醫學家認為，腎在月經產生的機理當中，具有相當于下丘腦-垂體-卵巢軸中下丘腦一級的調節功能，可調控卵巢的排卵及內分泌功能［8、9］。中醫名家羅元愷教授認為，不排卵者多數為腎陽虛衰，腎陽虛具有垂體-腎上腺皮質系統功能低下的表現［7］。羅氏促排卵湯的處方藥物有:菟絲子、制巴戟、淫羊藿、當歸、黨參、炙甘草、熟附子、熟地、枸杞子，全方以補腎助陽為主，佐以健脾養血填精，陰陽并重，臨床應用于腎陽虛為主的不孕癥患者。

本實驗SD大鼠羥基脲造模成功后，予以補腎法治療干預，包括羅氏促排卵湯煎劑、針刺加電針、羅氏促排卵湯煎劑+針刺加電針進行治療干預，治療后與雄鼠合籠，可以使治療各組的大鼠妊娠率增加，子宮、卵巢濕重也有不同程度的增加，特別是針灸組子宮濕重的增加有統計學意義，說明針灸治療能有效刺激排卵，增加妊娠數從而增加子宮重量。而腎、腎上腺、脾、腦垂體的變化不明顯，考慮羥基脲腎虛造模對腎、腎上腺、脾、腦垂體的影響不大，故而治療干預后各組之間也無明顯差異性。模型組大鼠造模成功后，沒有其他干預措施，本身有自然恢復傾向，對實驗結果有一定影響。

3.3 針灸治療不孕癥

針灸療法治療不孕癥，歷史久遠。現代研究提示，針灸治療不孕癥組要通過以下幾個途徑起作用:①針刺調節下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，使內分泌激素水平改變，生殖內分泌功能恢復正常;②針灸可使患者處于低水平的尿17-羥和尿-17酮含量增高，認為針灸有增強腎上腺皮質功能與調節性腺軸的作用;③對于輸卵管炎癥及阻塞性不孕癥，針灸治療可改善微循環及血流變性質，從而促進炎癥、壞死組織的吸收和消退，加快組織的修復和再生，有利于輸卵管的通暢。針灸對體內的性激素有雙向調節作用，可通過興奮下丘腦-垂體系統而使性腺激素分泌增加，在此過程中可能有某些神經遞質參與，調節促性腺激素釋放激素(GnRH)而影響性腺的分泌。針灸療法對卵巢的影響，可以促進排卵，效果基于一定的雌激素水平，針后出現皮膚溫度升高，即交感神經中樞受抑制效果較后。電針可以影響內啡肽物質和下丘腦-垂體-卵巢軸的功能而排卵。許爽君等觀察針刺配合補腎調沖中藥對治療功能性無排卵患者的促排卵作用。結果提示，治療后排卵率達74.8%，基礎體溫連續測定雙相率明顯提高，卵泡及子宮內膜生長發育比較顯示治療后比治療前顯著增加，血清雌二醇和孕酮水平亦比治療前明顯提高，這就表明針刺配合補腎調沖中藥有較好的促進血清雌二醇和孕酮正常分泌的作用，能明顯促進卵泡及子宮內膜的生長發育，有強烈的促排卵、健內膜作用，可顯著提高排卵和妊娠率［8］。馬瑞芬等對不孕癥患者72例采用針刺療法，觀察其促排卵與血相關指標的變化，結果顯示針刺可使脈沖頻率低者加速而促使卵泡生長排卵，促排卵是通過中樞起效，針刺治療后血E2水平也有不同程度的上升［9］。

本實驗所選穴位包括關元、中極、子宮、腎俞。關元，中極屬于任脈，均為任脈與足三陰經的交會穴，位于臍下，鄰近胞宮，關元為元陰元陽關藏之處，能調和沖任，通于肝脾腎三經，燮理元陰元陽，取此二穴位既能健脾導滯，又能疏肝理氣行瘀，還能補益腎陽腎陰，調和充任氣血。腎俞穴為腎的背俞穴，是腎臟精氣聚集處，取之能補益腎陽，暖功散寒。子宮穴為治療婦科疾病的經外奇穴及經驗穴，取之能調經種子，理氣止痛。本實驗選用關元、中極、子宮、腎俞的穴位，均位于腹部及背部，比較容易固定，因大鼠好動依從性差，可以順利完成針刺和電針操作。本實驗結果也提示，針刺治療何以改善內分泌水平，提高妊娠率，模型組大鼠造模成功后，沒有其他干預措施，本身有自然恢復傾向，對實驗結果有一定影響。由于樣本含量不夠大，雖然不同組別大鼠實驗結果有變化，但有一些在統計學上差異無顯著性。

4 結論

通過對SD大鼠羥基脲造模形成腎虛排卵障礙的動物模型進行治療的實驗研究，可以得出以下結論。

4.1 應用羥基脲造?？梢猿晒υ斐赡I虛排卵抑制大鼠動物模型，并以腎虛癥狀為主，兼見脾虛的癥狀。

4.2 補腎法包括補腎復方和/或針刺加電針對腎虛-排卵抑制病理模型大鼠進行治療，可以有效提高大鼠的妊娠率、妊娠胚胎數目，不同程度增加子宮及卵巢濕重，但對大鼠其他臟器濕重、內分泌指標的影響無統計學意義。

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△指導老師

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0567-03

2009-11-08