MMP-3啟動子基因多態(tài)性與大腦中動脈狹窄的關(guān)聯(lián)性研究

付春麗, 邢英琦, 宋曉南

動脈粥樣硬化常常是引起血管狹窄和閉塞的主要原因,其發(fā)生與炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(The matrix metalloproteinases,MMPs)的相互作用密切相關(guān)。MMPs是分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類中最主要的一類,它參與血管再生,炎癥反應(yīng)等病理過程,是可以降解細(xì)胞外基質(zhì)分子的鋅依賴性酶,主要降解基底膜的細(xì)胞外基質(zhì)成分。其中 MMP-3能夠激活其他酶原形成一正反饋環(huán),在 MMP家族激活過程中具有關(guān)鍵作用。目前生理學(xué)證明基因的改變可以精確的調(diào)控 MMPs酶原及其抑制劑的活性。MMPs活性調(diào)控的破壞已經(jīng)成為動脈粥樣硬化、炎癥、血管再生和腫瘤形成共有的病理過程。目前國外研究顯示 MMP-3啟動子的基因多態(tài)性與頸動脈狹窄有關(guān)[1]。而國內(nèi)尚未有關(guān) MMP-3基因多態(tài)性與顱內(nèi)大動脈狹窄的關(guān)聯(lián)性研究。本研究收集北方漢族人群大腦中動脈狹窄病例與相應(yīng)對照組,擬探討 MMP-3基因啟動子區(qū)多態(tài)性與大腦中動脈狹窄風(fēng)險的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

119例大腦中動脈狹窄(病例組)為 2006年 1月 ～2009年 6月于吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)顱多普勒超聲(TCD)證實為大腦中動脈狹窄的中國北方漢族患者,92例作為對照的北方漢族人群(對照組)經(jīng)顱內(nèi)彩色多普勒超聲 TCD檢測無異常。所有研究對象均知情同意。詳細(xì)詢問病史,重點是腦血管病危險因素病史。記錄所有研究對象年齡,性別,癥狀,TCD結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

以 EDTA抗凝,抽取兩組人群外周靜脈血 2～3 ml,-20℃保存。采用全血 DNA提取試劑盒(Takara,大連寶生物)提取白細(xì)胞 DNA,-70℃保存。

1.2.2 MMP3基因分型采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) (PCR-RFLP)方法

(1)PCR擴增 MMP-3啟動子 -1171(5A/6A)位點及其側(cè)翼區(qū):正向引物序列為:5'-GGTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAgA-3';反向引物序列為:5'-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3'。將正向引物 3'末端的第二個核苷酸 A換為 G以便于在 5A等位基因上產(chǎn)生 Tth111I(GACNNNGTC)的識別位點。PCR反應(yīng)體系是:10×PCR buffer 5μl,dNTP 4μl,正反向引物各 1μl,Ex Taq酶(TaKa-Ra,大連寶生物 )0.25μl,模板 3 ～5μl,滅菌雙蒸水定容至 50μl。 PCR反應(yīng)條件:94℃ 5min(預(yù)變性);94℃(變性)30s,65℃(退火)30s,72℃(延伸 )30s,共30個循環(huán);72℃10min。其中每次 PCR反應(yīng)均設(shè)有陰性對照,即用無菌雙蒸水替代模板,確保 PCR反應(yīng)無污染。

(2)電泳:將適量 PCR產(chǎn)物加相應(yīng)量的 6×Loading Buffer混勻后,在 3%瓊脂糖凝膠中電泳,電泳條件為:輸出電壓 100V,20min,紫外燈下觀察電泳結(jié)果(見圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

(3)酶切:酶切體系為:Tth111 I 1μl;10×酶切buffer 2μl;PCR產(chǎn)物 4μl;滅菌雙蒸水定容至 20μl。65℃下反應(yīng) 3h,3%瓊脂糖凝膠電泳,6A/6A基因型無酶切位點,故酶切后仍為 129bp一條帶;5A/6A基因型中 5A可被切開,故酶切后為 129bp,97bp,32bp 3條帶,其中 32bp太小在電泳圖中看不到;5A/5A則可被切為 97bp與 32bp兩條帶.每次酶切反應(yīng)設(shè)有陽性對照,保證酶切的準(zhǔn)確性(見圖2)。

(4)PCR產(chǎn)物測序,見圖3。

圖2 酶切產(chǎn)物電泳圖

圖3 此標(biāo)本為 6A/6A型其中的一條鏈測序圖

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 13.0分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以±s表示,采用非配對 t檢驗;計數(shù)資料以百分比表示,采用 χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對照組危險因素比較

兩組平均年齡無明顯差別,而病例組中男性,高血壓病史,糖尿病病史及吸煙史明顯多于對照組(P＜0.05)。高血脂病史及飲酒史兩組之間無明顯差別(見表1)。

2.2 平衡檢驗

病例組與對照組等位基因頻率均符合 Hardy-Weinberg平衡=2.12,P＞0.05=3.22,P＞0.05)。

2.3 兩組 MMP-3基因型及等位基因頻率比較

MMP-3基因型和等位基因頻率在兩組之間分布無明顯差別(P＞0.05)。所有高血壓病,糖尿病,有吸煙史及有相應(yīng)臨床癥狀患者病例組和對照組之間分別進(jìn)行基因型和等位基因頻率比較,差別無顯著性 (P＞0.05)(見表2、表3)。

表1 病例組與對照組危險因素比較

表2 MMP-3在各類病例組與對照組的基因型頻率及其相關(guān)性分析

表3 MMP-3在各類病例組與對照組的等位基因頻率及其相關(guān)性分析

3 討 論

MMPs是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)。目前認(rèn)為,血管重建是動脈粥樣硬化和血管再狹窄的主要病理學(xué)過程[2],而 MMPs在血管重建中起著非常重要的作用[3]。

MMP-3又稱基質(zhì)溶解素 1,可降解Ⅱ、IV、IX型膠原,層粘連蛋白,纖維結(jié)合蛋白,蛋白聚糖,彈力蛋白和明膠劑等底物,并可激活其他 MMP,如激活MMP-1前體成為 MMP-1,而 MMP-1可降解Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ型膠原,所以 MMP-3在 MMP家族激活過程中具有關(guān)鍵作用。MMP-3基因位于染色體 11q22.3,其存在多種基因多態(tài)性,但 MMP-3單倍體效應(yīng)主要取決于啟動子區(qū)域-1171 bp5A/6A基因多態(tài)性[4]。體外培養(yǎng)纖維母細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞實驗表明 5A等位基因比 6A等位基因具有更高活性,光譜移位分析顯示一種抑制轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白與 6A結(jié)合更緊密,因此提示攜帶 6A等位基因的人群由于轉(zhuǎn)錄活性降低,表達(dá)減少,從而使得細(xì)胞外基質(zhì)積累,導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成[5]。在腦動脈粥樣硬化等原因引起的血管病變基礎(chǔ)上,管腔狹窄、閉塞或有血栓形成,造成局部腦組織缺血。

本研究的結(jié)果顯示在本研究組中 5A和 6A等位基因頻率分別為 0.16和 0.84,與其他西方學(xué)者報告的頻率分布有所不同,5A純合子基因型明顯較少;但與國內(nèi)關(guān)于 MMP-3基因多態(tài)性與疾病的研究中等位基因頻率相似[6,7];MMP-3啟動子區(qū)-1171 5A6A基因多態(tài)性與大腦中動脈狹窄無明顯關(guān)聯(lián)。但病例組性別,高血壓病病史,糖尿病病史,吸煙史與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。可以說明 MMP-3啟動子區(qū) 5A/6A多態(tài)性可能不是大腦中動脈狹窄的獨立危險因素,而更證實了性別,高血壓病史,糖尿病病史及吸煙史在大腦中動脈狹窄形成中起著重要作用。同時頸動脈內(nèi)-中膜厚度(Intima media thickness,IMT)在兩組之間分布有明顯差別(P＜0.05),有證據(jù)顯示[8],頸動脈 IMT是動脈粥樣硬化早期可靠的檢測指標(biāo)。故頸動脈 IMT可作為大腦中動脈狹窄的一個標(biāo)識。

大約 18年前,Henney等人就發(fā)現(xiàn)在人類動脈粥樣硬化斑塊中有編碼 MMP-3的信使 RNA表達(dá)[9]。關(guān)于無動脈粥樣硬化危險因素的健康白種人的研究顯示,6A等位基因與頸動脈內(nèi)膜厚度增加有關(guān)聯(lián)[10,11]。與此同時曼哈頓島對未患卒中的西班牙人的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果[12],意大利同樣發(fā)現(xiàn)MMP-3 5A/5A基因多態(tài)性 6A6A基因型與頸動脈狹窄存在一定關(guān)聯(lián)[1]。但是在對金屬蛋白酶-3基因多態(tài)性與糖尿病患者頸動脈重構(gòu)的關(guān)聯(lián)性研究中發(fā)現(xiàn),其 5A/6A多態(tài)性與正常人群中頸動脈重構(gòu)有關(guān),而在糖尿病患者中并未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性[13]。國內(nèi)有關(guān) MMP-3 5A/6A基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系的研究中認(rèn)為其基因多態(tài)性與冠心病,心肌梗死危險性無明顯相關(guān)[6],及關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶-3啟動子基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的研究[14]與本研究結(jié)果一致。分析原因可能有以下幾點:(1)種族不同。國外研究的多為白種人,本研究的研究對象是中國北方漢族人群,兩種人群的生活及飲食習(xí)慣完全不同,觀察國外 5A等位基因頻率分布明顯高于國人,考慮人種為不可忽視的一個因素。(2)研究對象是否有動脈粥樣硬化危險因素。激素、生長因子、化學(xué)性病因、細(xì)胞因子、生理應(yīng)激及癌細(xì)胞等等均可影響MMPs的轉(zhuǎn)錄。故吸煙,高血壓或糖尿病等危險因素可能通過某種途徑影響 MMP-3的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致陰性結(jié)果,但 Giorgio Ghilardi[1]等對 MMP-3 6A/5A多態(tài)性與頸內(nèi)動脈狹窄的研究對象中有以上危險因素,同樣有關(guān)聯(lián),與此觀點不一致。(3)本研究中的研究對象數(shù)量有限,可能存在抽樣誤差。因此需進(jìn)行更大樣本的研究以進(jìn)一步論證。

總之,本研究顯示 MMP-3啟動子-1171 5A/6A基因多態(tài)性不能作為北方漢族人群大腦中動脈狹窄的一個獨立危險因素,可能在其他基因位點有與之相關(guān)的多態(tài)性,而性別、高血壓、糖尿病、吸煙史是大腦中動脈狹窄的危險因素,提示對腦血管狹窄或腦血管病應(yīng)積極進(jìn)行一級預(yù)防和二級預(yù)防。在今后對血管狹窄的研究中,應(yīng)擴大樣本量,收集更為匹配的研究對象,減少誤差。同時注意人種問題,不同的人種發(fā)病機制可能有所不同。

[1] Ghilardi G,Biondi ML,DeMonti M,et al.Matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-3 gene promoter polymorphisms are associated with carotid artery stenosis[J].Stroke,2002,33:2408-2412.

[2] Gibbons GH,Dzau VJ.The emerging concept of vascular remodelling[J].N Engl JMed,1994,330:1431-1438.

[3] Galis ZS,Khatri JJ.Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis.The good,the bad,and the ugly[J].Circ Res,2002,90:251-262.

[4] Zhou X,Huang J,Chen J,et al.Haplotype analysis of the matrix metalloproteinase-3 gene and myocardial infarction in a Chinese Han population[J].Thrombosis＆Haemostasis,2004,92:867-873.

[5] Ye S,Eriksson P,Hamsten A,et al.Progression of coronary atherosclerosis is associated with a common genetic variant of the human stromelysin-1 promoter which results in reduced gene expression[J].Biological Chemistry,1996,271:13055-13060.

[6] 高 波,李忠誠.基質(zhì)金屬蛋白酶-3血漿水平及其啟動子基因5A/6A多態(tài)性與冠心病關(guān)系的研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2004,16(9):536-539.

[7] 李 琰,王 瑛,康 山,等.基質(zhì)金屬蛋白酶 1、3基因多態(tài)性與卵巢癌遺傳易感性關(guān)系的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2005,40(7):472-475.

[8] Brenner D,Labreuche J,Touboul PJ,et al.Cytokine Polymorphisms Associated With Carotid Intima-Media Thickness in Stroke Patients[J].Stroke,2006,37:1691-1696.

[9] Henney AM,Wakeley PR,Davies MJ,et al.Localization of stromelysin gene expression in atherosclerotic plaques by in situ hybridization[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:8154-8158.

[10] Gnasso A,Motti C,Irace C,et al.Genetic variation in human stromelysin gene promoter and common carotid geometry in healthy male subjects[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:1600-1605.

[11] Rauramaa R,Vaisanen SB,Luong LA,et al.Stromelysin-1 and interleukin-6 gene promoter polymorphisms are determinants of asymptomatic carotid artery atherosclerosis[J].Arterioscle Thromb Vasc Biol,2000,20:2657-2662.

[12] Rundek T,Elkind MS,Pittman J,et al.Carotid intima-media thickness is associated with allelic variants of stromelysin-1,interleukin-6,and hepatic lipase genes:the Northern Manhattan Prospective Cohort Study[J].Stroke,2002,33:1420-1423.

[13] Irace C,Cortese C,Migale M,et al.Stromelysin gene promoter polymorphism and common carotid geometry in diabetic subjects[J].International Angiology,2008,27,5:413-418.

[14] 林文華,吳 江.基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性研究[R].第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會論文匯編,2008.654.