人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環氧合酶－2表達的影響＊

李永領 項洪武 朱烈烈 陳大慶

人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環氧合酶－2表達的影響＊

李永領 項洪武 朱烈烈 陳大慶

目的 觀察人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環氧合酶(cyclooxgenase－2，COX－2)mRNA表達的影響。方法選取健康wistar大鼠56只，分為正常對照組、模型組和人參皂苷組，Feeney法制作重度顱腦外傷模型，人參皂苷組在造模前30min按5mg/kg灌胃人參皂苷。造模后6、24、72h共3個時相點取各組大鼠腦組織，應用RT－PCR法檢測各組神經細胞COX－2 mRNA的表達。結果正常對照組未見COX－2 mRNA的表達;模型組和人參皂苷組腦外傷后6h出現COX－2 mRNA的表達，24h達到高峰，72h后明顯減少;人參皂苷組各個時間點COX－2 mRNA的表達明顯低于模型組。結論重度腦外傷存在COX－2 mRNA的異常表達，人參皂苷能抑制COX－2 mRNA的表達，可能對腦外傷有一定的保護作用。

人參皂苷 重度顱腦外傷 環氧合酶－2

溫州醫學院附屬第二醫院(溫州325027)

＊溫州醫學院附屬第二醫院院級課題(No.2007yy13)

重度顱腦外傷有著較高的致殘率和死亡率，隨著研究的深入，對顱腦外傷后繼發性腦損傷在創傷后病理生理過程中的認識也逐步加深，其中炎癥是繼發性腦損傷的一個重要組成環節。環氧合酶－2(cyclooxgenase－2，COX－2)是花生四烯酸代謝的限速酶，后者產生的前列腺素及血栓素是腦創傷后炎癥級聯反應的重要介質。本研究觀察大鼠重度顱腦外傷后COX－2 mRNA的表達變化及人參皂苷對其的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:健康雄性wistar大鼠56只(溫州醫學院實驗動物中心)，體質量170～250g。試藥:人參皂苷購自上海市藥品檢驗所，純度94.7%;Trizol液購自加拿大BBI公司;MMLV逆轉錄酶購自日本TOYOBA公司;引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。PCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司。儀器:高速低溫離心機(Allegra64R Centrifuge，美國Beckman公司);低溫冰箱 (R－404A，美國Forma Scientific公司);PCR儀(GeneAmp9600，美國Perkin Elmer公司);紫外透射反射儀(FS－312，上海復生生物工程研究所);凝膠成像系統(Gene，USA)及Scanband圖像分析軟件系統。

1.2 分組及建模 56只大鼠隨機分為正常對照組8只，模型組24只，人參皂苷組24只(術前30min按5.0mg/kg灌胃人參皂苷溶液)。模型組及人參皂苷組以5%氯胺酮80～100mg/kg腹腔內注射，將麻醉后的大鼠俯臥固定于自制的簡易落體致傷裝置。參照Feeney法[1]將頂部皮膚矢狀切開，在“人”字縫前3mm、中線右3mm頂部顱骨鉆孔并擴大骨窗(直徑5mm)，不越過中線，暴露硬膜，將底面直徑3mm的致傷撞墊輕輕置于骨窗中央的硬膜上，用20g重物自40cm高處沿滑桿垂直落下打擊撞墊(沖擊力為800g·cm)，造成大鼠右頂葉局限性腦挫裂傷，間斷縫合頭皮，整個過程均無菌操作。于術后6、24、72h分別將大鼠處死，無菌下開顱取部分外傷腦組織，－70℃保存備測。

1.3 RT－PCR法 用Trizol一步法提取細胞總RNA。逆轉錄體系為 20μL: 細胞總 RNA3μL(2.5～3μg)，10U/μL RNAsin 1μL，5 ×逆轉錄反應緩沖液 4μL，10μmol/L dNTP 2μL，25pmol/μmL隨機引物1μL，MMLV逆轉錄酶100U，25mmol/L MgCl2 0.5μL。30℃反應 10min，42℃反應 20min，99℃反應 5min，終止反應。引物根據軟件Oligo6.0設計。COX－2上游引物:5'－ACG GAC TTG CTC ACT TTG－3'，下游引物:3'－CAT TAG GGT AGA CAA GAG－5';擴增片段長度376bp。內參照β－肌動蛋白上游引物:5'－ACG TTG ACA TCC GTA AAG －3'，下游引物:3'－CGG AGT GAC AGG TGG AAG－5';擴增片段長度200bp。PCR擴增體系為 25μL:逆轉錄產物 2μL(0.1 ～2μg)，10pmol/μL 上、下游引物各 2.5μL，PCR Master Mix12.5μL，其余以無核酶水補足至25μL。擴增條件:94℃反應10min，94℃反應45s，58℃反應1min，72℃反應1min，共35個循環，最后72℃延伸5min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V，35min)后，紫外透射儀下觀察并照相，在凝膠上進行掃描定量，以目的基因與內參照的熒光比值代表mRNA的表達水平。

2 結果

見圖1、表1。模型組和人參皂苷組各個時相點均可見COX－2 mRNA的表達。正常對照組未見COX－2 mRNA的表達，模型組腦外傷后6h出現COX－2 mRNA的表達，24h達到高峰，72h后明顯減少，與正常對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05);人參皂苷組各個時間點COX－2 mRNA的表達均低于模型組(P ＜ 0.05)。

3 討論

人參總皂苷含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1等主要活性成分，具有改善微循環、抗自由基、阻止鈣離子內流和抑制炎癥反應多重作用[2]。

表1 各組COX－2 mRNA表達比較 (±s)

表1 各組COX－2 mRNA表達比較 (±s)

與正常對照組比較，＊P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

傷后24h 傷后72h組 別正常對照組模型組人參皂苷組n 8 2 4 24傷后6h 0.0000 ± 0.0000 0.0602 ± 0.1301＊0.0421 ±0.1001＊△0.1462 ±0.1002＊△0.0903 ±0.0921＊△0.1027 ± 0.0832＊0.0804 ± 0.0975＊△

圖1 COX－2 mRNA在實驗組中的表達

在生理狀態下，COX－2在大多數組織中以極低拷貝數表達。但脂多糖、白細胞介素－1、腫瘤壞死因子、血清、表皮生長因子α和血小板活化因子等許多炎癥刺激因子均可誘導COX－2的基因表達，參與炎癥反應和多種疾病的病理過程，且蛋白合成抑制劑不能抑制COX－2 mRNA的表達，因此COX－2是一種即時基因。COX－2主要存在于神經細胞。腦損傷時，COX－2及其代謝產物至少可在脈管系統、血腦屏障和神經元本身3個環節加重腦損傷。本研究結果顯示正常腦組織中未見COX－2 mRNA的表達，腦外傷后6h出現COX－2 mRNA的表達，24h達到高峰，72h后COX－2的表達明顯減少。Strauss等[3]應用免疫斑點技術對大鼠腦損傷后COX－2蛋白表達研究發現，腦損傷后損傷區腦皮質COX－2表達在1d時顯著增加，3d達高峰。而海馬區COX－2表達腦損傷后2h開始增加，1d達高峰，3d下降至正常水平。Strauss等[3]應用原位雜交技術對腦損傷COX－2 mRNA含量進行研究時還發現，外傷后2～6h COX－2 mRNA含量在皮質及海馬均開始增加，24h達高峰，72h時仍高于正常水平。Kunz等[4]對外傷后COX－2 mRNA含量的研究結果與Schwab等[5]相似。這種變化趨勢與本研究結果一致。

本研究還發現，人參皂苷組各個時相點COX－2 mRNA的表達均低于模型組，說明人參皂苷能明顯抑制這種異常表達。因COX－2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，而前列腺素是非常重要的炎性因子，故通過抑制COX－2活性可有效地降低炎性反應。因此，在腦外傷早期應用人參皂苷，對重型腦外傷可能具有保護作用。

[1]Feeney.D M，Boyeson M G，Linn R T，et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res，1981，211(1):67 －77.

[2]吳曉燕.人參總皂苷對大鼠缺血再灌注后神經元凋亡的保護及作用機制的研究 [J].神經疾病與精神衛生，2005，5(5):347－350.

[3]Strauss K I，Barbe M F， Marshall R M， et al.Prolonged cyclooxygenase－2 induction in neurons and glia following traumatic brain injury in the rat[J].J Neurotrauma， 2000， 17(8):695 －711.

[4]Kunz T， Marklund N， Hillered L， et al. Cyclooxygenase－2，prostaglandin synthases，and prostaglandin H2 metabolism in traumatic brain injury in the rat [J].J Neurotrauma， 2002， 19(9):1051－1064.

[5]Schwab J M， Beschorner R，Meyermann R，et al.Persistent accumulation of cyclooxygenase－ 1－expressing microglial cells and macrophages and transient upregulation by endothelium in human brain injury[J].J Neurosurg， 2002， 96(5):892 － 899.

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