5-氯苯并三唑對重組人蛋白激酶CK2全酶活性的影響*

5-氯苯并三唑對重組人蛋白激酶CK2全酶活性的影響*

李春梅1，2)，林小聰2)，劉新光2)#，陳小文2，3)，梁念慈2)
1)廣東藥學院生物化學與分子生物學教研室廣州510006 2)廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所湛江524023 3)深圳市兒童醫院兒科研究所深圳518026
#通訊作者，男，1964年10月生，博士，教授，研究方向：生物化學，E-mail：xgliu64@126.com

蛋白激酶CK2;重組蛋白;全酶;5-氯苯并三唑;酶動力學

目的：觀察5-氯苯并三唑對重組人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶動力學機制。方法：在體外等物質的量混合CK2 α’和β亞基構成重組CK2全酶。以重組人CK2全酶為分子靶點，通過測定轉移到CK2底物上的γ-32P ATP的32P放射活度來檢測不同濃度5-氯苯并三唑對CK2活性的影響，并進行動力學分析。結果：0、1、3、9、27、81及243 μmol/L的5-氯苯并三唑對重組人CK2全酶均具有抑制作用，且該作用隨濃度的增加而增強(F= 165.552，P＜0.001)，IC50為20.10 μmol/L;它與ATP呈競爭性抑制CK2的活性，抑制常數Ki為18.63 μmol/L;與酪蛋白呈非競爭性抑制CK2的活性，抑制常數Ki為22.58 μmol/L。結論：5-氯苯并三唑是重組人蛋白激酶CK2的抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料 5-氯苯并三唑購自美國Aldrich公司;肝素、精胺及ATP購自美國Sigma公司;P81磷酸纖維素濾紙購自英國Whatman公司;γ-32P ATP購自北京福瑞生物工程公司;其余試劑為國產分析純產品。重組人CK2α’和β亞基的原核表達、純化與鑒定參見文獻［8-10］，將純化的重組人CK2α’與β亞基等物質的量混合構成重組人CK2全酶。

1.2 5-氯苯并三唑對重組人CK2全酶活性的影響

將5-氯苯并三唑稀釋到0、1、3、9、27、81及243 μmol/L，每反應管加入受試藥物10 μL，再加入反應混合液15 μL［含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，50 μmol/L ATP，γ-32P ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L］，最后加入重組CK2全酶10 μL，室溫反應10 min后取30 μL點至直徑2 cm的P81磷酸纖維素濾紙上終止反應，陰干，用85 mmol/ L磷酸洗滌數次，最后用丙酮洗滌1次，80℃烤干后加閃爍液，液閃儀計數。每min催化1 pmol γ-32P ATP上的32P轉移到酪蛋白上所需的酶量為1個酶活性單位(cpm)。根據半數效量概率單位法［11］計算IC50：以濃度的對數為橫坐標，以相應濃度抑制率的概率單位為縱坐標，做圖并求出直線回歸方程，根據方程計算IC50值(50%抑制時的概率單位為5)。

1.3 5-氯苯并三唑對重組人CK2全酶影響的動力學分析 根據IC50結果，選擇3種不同藥物濃度(0，10，40 μmol/L)進行實驗分組。在固定酪蛋白濃度為2 g/L、ATP濃度為10～80 μmol/L情況下，測定CK2的活性(相當于反應速度);或在固定ATP濃度為10 μmol/L、酪蛋白濃度(1～8 g/L)條件下，測定CK2活性。各分別進行3次獨立實驗，每次實驗每個樣品同時做3個平行管。采用Lineweaver-Burk做圖法，以1/S和1/V做圖顯示酶的動力學結果(S表示底物濃度，V表示反應速度)，求出酶動力學參數表觀米氏常數Km和表觀最大反應速度Vmax，以此判斷5-氯苯并三唑對CK2抑制作用的類型;根據上述動力學參數計算得出抑制常數K［12］。

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1.4 統計學處理 應用SPSS 11.0進行統計分析，對不同濃度5-氯苯并三唑作用后重組人全酶活性的影響比較用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5-氯苯并三唑對重組人CK2全酶活性的抑制作用 實驗結果表明，5-氯苯并三唑對重組人CK2全酶有較強的抑制作用，該作用隨藥物濃度的增加而增強(表1)。根據效量概率單位法求出的直線回歸方程為：Y=1.117 4X+3.543 2(R2=0.997 9)，其IC50為20.10 μmol/L。

表1 5-氯苯并三唑對重組人蛋白激酶CK2全酶活性的影響(n=3)

2.2 酶動力學分析結果

2.2.1 不同濃度ATP條件下5-氯苯并三唑對CK2作用的動力學分析 動力學結果見圖1，表2。

圖1 不同濃度ATP條件下

表2 不同濃度ATP條件下5-氯苯并三唑對CK 2作用的動力學分析結果

可以看出，隨著藥物濃度的增加，Km增大，而Vmax基本不變，雙倒數作圖的交點位于縱坐標上，因此5-氯苯并三唑與ATP呈競爭性抑制重組人CK2全酶活性。抑制常數Ki為18.63 μmol/L。

2.2.2 不同濃度酪蛋白條件下5-氯苯并三唑對CK2作用的動力學分析 動力學結果見圖2，表3。

圖2 不同濃度酪蛋白條件下

表3 不同酪蛋白濃度條件下5-氯苯并三唑對CK 2作用的動力學分析結果

雙倒數作圖的交點位于橫坐標上，因此5-氯苯并三唑與酪蛋白對重組人CK2活性的作用屬于非競爭性抑制，抑制常數Ki為22.58 μmol/L。

3 討論

作者觀察了鹵代苯并三唑衍生物中的一種——5-氯苯并三唑對重組人蛋白激酶CK2全酶的作用，并進行酶動力學分析。結果表明，5-氯苯并三唑能明顯抑制蛋白激酶CK2全酶的活性，IC50為20.10 μmol/L;而且它與ATP呈競爭性抑制 CK2活性(Ki=18.63 μmol/L)，與酪蛋白呈非競爭性抑制CK2活性(Ki=22.58 μmol/L)。5-氯苯并三唑對CK2的抑制活性和親和作用小于傳統的CK2抑制劑——5，6-二氯 1-β-D-呋喃核糖苯并咪唑［12］(DRB，其化學結構見圖3A，IC50為13 μmol/L，Ki為23 μmol/L)和4，5，6，7-四溴苯并三唑［6］(TBB，其化學結構見圖3B，IC50為0.9μmol/L，Ki＜1 μmol/L)。這可能是由它的結構特點決定的：三唑環取代了咪唑環，可能增加了其抑制活性;但是鹵素含量減少，可能又降低了其抑制活性。

圖3 2個有效的CK 2抑制劑的化學結構圖

［1］Wang G，Ahmad KA，Unger G，et al.CK2 signaling in androgen-dependent and-independent prostate cancer［J］.J Cell Biochem，2006，99(2)：382

［2］Hamacher R，Saur D，Fritsch R，et al.Casein kinaseⅡinhibition induces apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Oncol Rep，2007，18(3)：695

［3］Battistutta R，Mazzorana M，Sarno S，et al.Inspecting the structure-activity relationship of protein kinase CK2 inhibitors derived froMtetrabromo-benzimidazole［J］.CheMBiol，2005，12(11)：1 211

［4］Tawfic S，Yu S，Wang H，et al.Protein kinase CK2 signal in neoplasia［J］.Histol Histopathol，2001，16(2)：573

［5］李春梅，劉新光，梁念慈.蛋白激酶CK2與HIV的生命周期［J］.國外醫學：臨床生物化學與檢驗學分冊，2002，23(4)：208

［6］Sarno S，Moro S，Meggio F，et al.Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors［J］.Pharmacol Ther，2002，93(2/3)：159

［7］Garcia-Echeverria C，Traxler P，Evans DB.ATP site-directed competitive and irreversible inhibitors of protein kinases［J］.Med Res Rev，2000，20(1)：28

［8］陳小文，劉新光，梁景耀，等.人蛋白激酶CK2α’亞基在大腸桿菌中的克隆、表達及其重組蛋白的純化與性質鑒定［J］.中國生物化學與分子生物學報，2004，20 (2)：176

［9］劉新光，梁念慈，馬澗泉，等.重組人蛋白激酶CK2β亞基cDNA的克隆與測序［J］.中國生物化學與分子生物學報，1999，15(2)：228

［10］劉新光，梁念慈，馬澗泉.重組人CK2β亞基的原核表達、純化與鑒定［J］.生物化學與生物物理進展，2000，27(2)：201

［11］楊樹勤.中國醫學百科全書——醫學統計學［M］.上海：上海科學技術出版社，1985：197

［12］Zandomeni R，Zandomeni MC，Shugar D，et al.Casein kinase type II is involved in the inhibition by 5，6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole of specific RNA polymerase II transcription［J］.J Biol Chem，1986，261(7)：3 414

(2009-03-30收稿 責任編輯王 曼)

Effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme

LI Chunmei1，2)，LIN Xiaocong2)，LIU Xinguang2)，CHEN Xiaowen2，3)，LIANG Nianci2)

1)Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou 510006 2)Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023 3)Paediatrics Institute，Shenzhen Children’s Hospital，Shenzhen 518026

蛋白激酶CK2是一種真核細胞中普遍存在的第二信使非依賴性蛋白激酶，在腫瘤的生長中發揮重要作用［1-4］。此外，其在HIV-1復制、轉錄及裂解細胞等功能的調控中起重要作用，一些CK2抑制劑具有抗HIV-1活性［5］。因此認為CK2在抗腫瘤及抗病毒藥物研究方面是一個具有吸引力的分子靶點，其特異性抑制劑具有潛在的臨床應用價值［6］。目前已知的CK2抑制劑多為ATP-結合位點的競爭性抑制劑，主要包括異喹啉衍生物、鹵代苯并咪唑/苯并三唑衍生物及天然的蒽醌衍生物［7］。CK2在組織細胞中含量極低，從組織中直接提取純化比較困難。為篩選CK2抑制劑，作者以重組CK2α’亞基與β亞基等物質的量混合構成的全酶［8-10］作為研究

*廣東省自然科學基金資助項目 05011579;廣東省醫學科研基金資助項目 B2007093

protein kinase CK2;recombinant protein;holoenzyme;5-chlorobenzotriazole;enzyme kinetics

Aim：To observe the direct effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant protein CK2 holoenzyme and its kinetics.Methods：The CK2 α’and β subunits were mixed at the same molar ratio and reconstituted CK2 holoenzyme.The recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme was used as a molecular target.The CK2 activity and its kinetic analysis were assayed by detecting incorporation of32P of［γ-32P］ATP into the substrate in the various conditions.Results：5-chlorobenzotriazole at 0，1，3，9，27，81 and 243 μmol/L inhibited the holoenzyme activity of recombinant human protein kinase CK2，and the effect strengthened with the increase of the concentration(F=165.552，P＜0.001).IC50=20.10 μmol/L.Kinetic studies of 5-chlorobenzotriazole on CK2 showed that the inhibition was competitive with ATP with the Kiof 18.63 μmol/L and noncompetitive with casein with the Kiof 22.58 μmol/L.Conclusion：5-chlorobenzotriazole is an effective inhibitor of CK2 holoenzyme.材料，觀察5-氯苯并三唑(鹵代苯并三唑類衍生物類抑制劑)對純化的重組人CK2全酶活性的影響，報道如下。

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