多聚鳥氨酸海藻酸鋇微囊物理性能和生物相容性研究

王健,邱麗媛,張文君,段翠密,郝彤,林秋霞,王常勇

海藻酸微囊包裹同種來源、異種來源的細胞或基因工程化細胞后可以較為有效地截割大分子的免疫活性物質(zhì)進入微囊內(nèi)部,避免細胞體內(nèi)移植后引發(fā)的免疫排斥反應(yīng);而允許小分子的營養(yǎng)物、分泌物等通過,使被包裹的細胞獲得各種營養(yǎng)物質(zhì)并正常行使其細胞生理功能,在各種疾病或代謝功能失調(diào)的治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。如:微囊化異體多巴胺能神經(jīng)元用于治療帕金森病[1],微囊化牛腎上腺嗜鉻細胞用于移植治療晚期癌痛[2],微囊化軟骨細胞治療骨軟骨缺損性疾病[3];特別是微囊化胰島細胞用于治療糖尿病[4],微囊化肝細胞移植治療肝功能衰竭和某些先天性肝代謝疾病[5-6]的深入研究使得微囊化技術(shù)受到越來越多的關(guān)注。

二價或多價陽離子是重要的海藻酸微囊制備材料,與海藻酸結(jié)合的陽離子的種類直接影響微囊的性能,通常使用最為廣泛的是Ca2+。李洪波等報道使用Ba2+替代Ca2+,制備的BPA微囊較之于APA微囊具備更好機械強度和生物相容性[7-8]。另外,多聚氨基酸是另一種重要的海藻酸微囊制備材料,其中以多聚賴氨酸(PLL)使用最為廣泛。但也有報道指出,多聚賴氨酸會導(dǎo)致微囊膜黏附成纖維細胞和巨噬細胞,產(chǎn)生多種細胞因子[9],降低微囊的長期穩(wěn)定性和生存力。根據(jù)Marcus等的報道使用多聚鳥氨酸(PLO)制備的APA微囊比多聚賴氨酸制備的APA微囊具有更好的物理性能,更好的生物相容性[10-11]。在此基礎(chǔ)之上,我們選用多聚鳥氨酸作為制囊多聚氨基酸,替代傳統(tǒng)的多聚賴氨酸,優(yōu)化制囊條件,制備出海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(Ba-alginate-Poly-L-Ornithine-Alginate microcapsules,B-PLO-A)微囊,對 PLO-和 PLL-包被的海藻酸鋇微囊的物理性能和生物相容性進行了對比。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 VARV1型靜電微囊發(fā)生儀(瑞典NISCO公司);搖床(江蘇太倉實驗設(shè)備廠)、海藻酸鈉(Sigma-Aldrich)、氯化鋇(Fluca)、多聚鳥氨酸(PLO HCl)(MW 1/4 15～30 kDa,Sigma-Aldrich)、多聚賴氨酸(Mw 1/4 15～30 kDa Sigma-Aldrich);枸櫞酸鈉(天津化學(xué)試劑一廠,分析純)。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley大鼠,體重180～200 g,雌雄兼有,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供。

1.3 微囊制備 用靜電微囊發(fā)生儀將2%海藻酸鈉溶液噴入氯化鋇溶液中,作用2 min,以形成海藻酸鋇微球。吸出氯化鋇溶液,使用生理鹽水洗滌2次(盡量將游離態(tài)Ba2+去除),再將微球分別與多聚鳥氨酸溶液/多聚賴氨酸反應(yīng)數(shù)分鐘,形成B-PLO-A和 B-PLL-A微球,再使用生理鹽水洗滌2次;之后,將兩種微膠珠與0.05%的海藻酸鈉溶液反應(yīng)數(shù)分鐘,中和微膠珠表面的正電荷,再將B-PLO-A和B-PLL-A微膠珠與枸櫞酸鈉溶液反應(yīng)數(shù)分鐘,液化囊芯,形成B-PLO-A和B-PLL-A微囊。

1.4 微囊在低滲環(huán)境的變化 分別將50個B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入盛有10 ml蒸餾水的平皿內(nèi),于37℃孵育2 h,然后用生理鹽水洗滌,再向平皿內(nèi)滴加0.5%臺盼藍2滴,搖勻,使微囊著色,以得到清晰的微囊輪廓。染色后繼續(xù)以生理鹽水洗滌,在光鏡下觀察微囊形態(tài),記錄孵育前后微囊直徑的變化,統(tǒng)計破損率。

1.5 微囊直徑變化測定 分別將100個B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理鹽水的100 ml燒杯中,封口膜將杯口封閉,于37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2周 ,分別在 0、2 d、4 d、6 d、8 d 、10 d 、12 d 、14 d 時取樣,在光鏡下計數(shù)B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊數(shù)量,統(tǒng)計微囊直徑變化。

1.6 微囊體外機械強度的測定 分別將450個BPLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理鹽水的100 ml燒杯中,封口膜將杯口封閉,于37℃,150 r/min的速度下在搖床上進行震蕩。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、96 h取樣,于光鏡下記錄 B-PLO-A 微囊和B-PLL-A微囊數(shù)、破損數(shù)量,同一批制備的微囊重復(fù)實驗10次,計算完整率。

1.7 B-PLO-A微囊生物相容性的測定 將B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊,植入SD大鼠腹腔內(nèi),分別于移植后1,2,4和8周,打開腹腔,肉眼觀察微囊在腹腔內(nèi)的分布情況。用生理鹽水注射沖洗腹腔,回收微囊,在光鏡下觀察微囊的形態(tài),同一批制備的微囊重復(fù)實驗5次,計算完整率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0進行單因素方差分析,顯著性檢驗采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的形態(tài) 所制作的B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊在光鏡下呈透明圓球形,膜表面光滑,微囊大小較均勻,直徑為350～500 μ m,兩者無明顯差異。見封三彩圖1.1。

2.2 微囊在低滲環(huán)境的變化 B-PLO-A微囊和BPLL-A微囊在蒸餾水的滲透應(yīng)力作用下均呈現(xiàn)了一定的尺寸增長趨勢,其中B-PLO-A微囊的直徑由孵育前的(429±14)μ m,增大為(464±14)μ m,B-PLL-A微囊的直徑由孵育前的(453±13)μ m,增大為(518±24)μ m,臺盼藍染色顯示B-PLL-A微囊表面出現(xiàn)部分破損變形現(xiàn)象,B-PLO-A微囊的破損率為16.98%,BPLL-A微囊的破損率為34.54%。見封三彩圖1.2。

2.3 微囊直徑變化測定 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊于37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2周,直徑初期均出現(xiàn)明顯增大,4 d后直徑變化趨緩,直至14 d直徑變化趨于穩(wěn)定;初期0～2 d內(nèi)B-PLO-A微囊直徑增大明顯小于B-PLL-A微囊。

2.4 微囊的體外機械強度 B-PLO-A微囊經(jīng)機械振蕩搖 12 h、24 h、36 h、48 h、96 h 的完整率分別為100%、100%、100%、99.5±0.9%、99.3±1.0%。BPLL-A微囊經(jīng)機械振蕩12 h時的完整率為100%,24 h時完整率為100%,36 h時完整率為(99.1±2.6)%,48 h時完整率為(97.9±1.7)%,96 h完整率(96.2±1.5)%。統(tǒng)計學(xué)分析表明,B-PLO-A微囊的機械強度在96 h后高于B-PLL-A微囊,表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。見表1。

表1 機械震蕩不同時間后B-PLL-A微囊和B-PLO-A微囊的完整率(n=50,%)

2.5 生物相容性 將B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊分別植入大鼠腹腔,于1、2、4和8周后打開腹腔,肉眼觀察見植入B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊的大鼠,腹腔內(nèi)表面及腹腔臟器表面均為光滑,無明顯的異常結(jié)節(jié),網(wǎng)膜血管附近有少量微囊附著。從腹腔內(nèi)回收的兩種微囊體積均超過植入微囊體積的90%。微囊呈透明圓球形,膜表面光滑,無結(jié)締組織包繞。見封三圖1.4。膜表面有結(jié)締組織包繞及少量細胞黏附,無明顯差異。各回收時間點微囊完整率見表2。

表2 植入大鼠體內(nèi)不同回收時間B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的完整率(%)

3 討論

海藻酸遇二價或多價陽離子,如:Ca2+或Ba2+,可與其古洛糖醛酸區(qū)域內(nèi)的羥基結(jié)合生成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以Ba2+替代Ca2+制備的BPA微囊已被證明具有更好的機械性能和生物相容性[7-8],原因是:在與海藻酸凝結(jié)成膠體的陽離子中,Ba2+離子毒性最小,與海藻酸的結(jié)合力較Ca2+更強[12],使得BPA微囊的長期穩(wěn)定性能更為優(yōu)越。低穩(wěn)定性的微囊,在體內(nèi)環(huán)境下容易發(fā)生形變,而誘發(fā)宿主纖維組織的包繞[13-15],因此,BPA微囊良好的物理穩(wěn)定性和機械強度又為其提供較好的生物相容性。還有研究表明,微囊的生物相容性很大程度上依靠其囊膜上多聚陽離子與海藻酸的結(jié)合效率[8],多聚鳥氨酸(PLO)以其與海藻酸更短的結(jié)合鍵,增強了這種結(jié)合效率,使得多聚鳥氨酸海藻酸(A-PLO-A)微囊具備比多聚賴氨酸海藻酸(A-PLLA)微囊更為優(yōu)秀的機械強度和生物相容性[10,16]。

本研究旨在將BPA微囊與PLO結(jié)合,制備出BPLO-A微囊,將其與使用PLL制備的BPA微囊進行物理性能和生物相容性比較,探討PLO用于BPA微囊的制備對其性能的影響。體外檢測結(jié)果表明,PLO與海藻酸更高的結(jié)合效率進一步增強微囊的機械強度,提高微囊抵御低滲環(huán)境的能力,對于維持微囊形態(tài)穩(wěn)定,保護包裹在其中的細胞提供保證;在體外培養(yǎng)14 d后,B-PLO-A微囊直徑變化較B-PLL-A微囊更小,說明B-PLO-A微囊的囊膜更為穩(wěn)定,能夠更為有效地抵御形變的發(fā)生,減少宿主纖維組織包繞的發(fā)生,為微囊化細胞長期生存創(chuàng)造了潛在條件。同時,在植入大鼠腹腔2個月后,大部分B-PLO-A微囊仍然保持原有的形態(tài),微囊完整、無結(jié)締組織包繞,表明B-PLOA微囊除物理性能較傳統(tǒng)的BPA微囊有所提高,其生物相容性良好。

綜上所述,我們制備的B-PLO-A微囊在B-PLLA微囊基礎(chǔ)上,體現(xiàn)出更好的物理性能,并保持良好的生物相容性,是一種極具應(yīng)用前景的生物材料,為微囊化細胞治療提供了新的思路。

[1]Yoshida H,Date I,Shingo T,et al.Stereotactic transplantation of a dopamine-producing capsule into the s triatum for treatment of Parkinson disease:a preclinical primate study[J].JNeurosurg,2003,98(4):874-881.

[2]杜智,周道標,李濤,等.APA微囊牛腎上腺嗜鉻細胞移植治療晚期癌痛研究[J].中國腫瘤臨床,2003,30(11):761-765.

[3]Mercier NR,Cos tantino HR,Tracy MA,et al.Poly(lactide-co-glycolide)microspheres as a moldable scaffold for cartilagetissue engineering[J].Biomaterials,2005,26(14):1945-1952.

[4]O'shea GM,Sun AM.Encapsulation of rat islets of Langerhans prolongs xenograft survial in diabetic mice[J].JAm Diabetes Assoc,1986,35:943.

[5]Umehara Y,Hakamada K,Seino K,et al.Improved survival and ammonia metabolism by intraperitoneal transplantation of microencapsulated hepatocytes in totally hepatectomized rats[J].Surgery,2001,130:513-520.

[6]Benoist S,Sarkis R,Honiger J,et al.Survival And functions of encapsulated porcine hepatocytes after allotransplantation or xenotransplantation without immunosuppression[J].Surgery,2001,129(5):606-616.

[7]Tanaka H,Irie S.Preparation of stable alginate gel beads in electrolyte solutions using Ba2+and Sr2+[J].Biotechnol Techn,1988,2:115-120.

[8]Li HB,Jiang H,Wang CY,et al.Comparison of two types of alginate microcapsules on stability and biocompatibility in vitro and in vivo[J].Biomed Mater,2006,(1):42-47.

[9]Duvivier-Kali VF,Omer A,Parent RJ,et al.Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane[J].Diabetes,2001,50:1689-1750.

[10]Darrabie MD,Kendall WF Jr,Opara EC.Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules[J].Biomaterials,2005,(26):6846-6852.

[11]Leung A,Lawrie G,Nielsen LK,et al.Synthesis and characterization of alginate/poly-L-ornithine/alginate microcapsules for local immunosuppression[J].Microencapsulation,2008,25(6):387-398.

[12]Haug A.Composition and properties of alginates[R].Report No.30,Norwegian Institute of Seaweed Research,1964:25-45.

[13]Hobbs HA,Kendall WF Jr,Darrabie M,et al.Prevention of morphological changes in alginate microcapsules for islet xenotransplantation[J].JInvestig Med,2001,49(6):572-575.

[14]de Vos P,Van Straaten JF,Nieuwenhuizen AG,et al.Why do microencapsulated islet grafts fail in the absence of fibrotic overgrowth?[J].Diabetes Nutr Metab,1999,48:1381-1388.

[15]de Groot M,Schuurs TA,van Schilfgaarde R.Causes of limited survival of microencapsulated pancreatic islet grafts[J].JSurg Res,2004,121(1):141-150.

[16]Leung A,Trau M,Nielsen LK.Assembly of multilayer PSS/PAH membrane on coherent alginate/PLO microcapsule for long-term graft transplantation[J].JBiomed Mater Res A,2009,88(1):226-237.