不同負荷游泳運動影響小鼠血管內皮生長因子在心室肌和心房肌的不同表達

孫楠,徐凱

(鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學系,河南 鄭州 450064)

長時間的力竭游泳運動可以導致多項生理機能的改變,很少有對其心室肌和心房肌分開來進行研究。本文不僅僅分析小鼠在力竭游泳后的心肌改變,還通過免疫組化手段來了解運動后小鼠心臟中心室肌和心房肌的改變狀況。在參照艾洪濱[1]等對正常小鼠的寬頻帶心電圖的研究以及步斌[2]的運動負荷與沙棘對大鼠心肌 VEGF表達影響的研究之后,采用游泳方法建立小鼠運動模型,觀察了不同運動負荷使小鼠心房肌和心室肌從形態到功能發生的改變。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 取 2月齡雄性昆明小鼠30只,每只體重約 (34±1.87)g(由湖北省實驗動物研究中心提供),用國家標準嚙齒類動物飼料飼養,生活期間室溫保持 (25±2)℃,相對濕度 (51%±4%),每天光照 8 h。適應性喂養 1周后,隨機分為 3組,每組 10只。

1.1.2 實驗儀器 常規手術器械;塑料水池(150 cm×32 cm×80 cm,自制);切片機 (LAICA,德國);隔水式電熱恒溫培養箱 (上海躍進醫療器械廠);機械不銹鋼燒烤微波爐 (格蘭仕);光學顯微鏡 (OLYMPUS,日本);圖像分析系統(IMAGE PRO PLUS 5.1,美國)。

1.1.3 免疫組化主要試劑 VEGF抗體 (一抗、二抗)、免疫組化 SP試劑盒、DAB均由武漢博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 先選取一只小鼠測試其無負重時的游泳時間,為 3 h;再分別以 2%、5%、8%的負重測試其游泳時間,以力竭為標準(力竭判斷標準為大鼠沉入水底 10 s不浮起,無法完成翻正反射),分別為 2 h30 min、2 h、1 h50 min,結合張志琪所作實驗[3],確定游泳時間為 2 h,尾部負體重的 5%。隨后將小鼠隨機分成三組：A.靜養對照組：平時不運動,飼養條件與另外兩組相同,每當另兩組小鼠訓練時,此組小鼠也放入溫度相同的淺水中,浸泡 120 min;B.120min組：進行中等強度游泳訓練,游泳池體積為 150 cm×32 cm×80 cm,水深 25 cm,水溫 (32±1)℃,每周訓練 6 d,每天訓練 1次。第一次下水 10 min,此后逐日累加到第一周末時游泳時間達到 60 min/d,第二周末達到 120 min/d。以后維持這一運動量直至第 8周;C.120 min+負重組：在與120min組訓練條件和方法相同的情況下,在同一時間放入水中,并且以光滑鐵棍對小鼠進行驅趕,使得小鼠在負重 5%體重的 120m in的時間里不間斷的進行運動,結束后即刻用毛巾擦干。

1.2.2 取材及標本制備 最后一次訓練完畢后即刻活體解剖,迅速打開胸腔,心室上作十字形切口,割斷大動靜脈,取出心臟,放入 4%多聚甲醛中固定。標本固定 2 h后,分別經濃度為 50%的酒精 2 h、70%的酒精 2 h、80%的酒精 1 h、90%的酒精 1 h、100%的酒精 1 h、100%的酒精 1 h進行脫水,脫水后經兩次二甲苯各 30min透明。隨后依次放進48～50℃、54～56℃、56～58℃的石蠟中浸蠟 1 h,石蠟包埋、切片。石蠟切片的厚度為 2μm。其它免疫組化方法依照博士德產品說明進行。

1.2.3 圖像分析方法 顯微鏡均取 ×40倍,每組測定 2張切片,每張切片隨機選取 4個視野進行圖像采集,視野主要集中在心肌的左心室上。以視野為單位,每組共 8個視野。利用 IMAGE PRO PLUS 5.1圖像分析軟件測量面積比。VEGF染色是否為陽性以 PBS液代替一抗所得切片對照作標準。

1.3 統計學處理 所有數據均經過 SPSS11.5統計軟件處理,所測數據采用平均值 ±標準差來表示,P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 三組小鼠一般情況的對比觀察 靜養對照組的小鼠神態安靜、活潑好動、時而靜息。皮毛光亮、眼睛有神,在配給相同類型食料的情況下,靜養對照組進食量與 120 min組相接近,而多于120min+負重組。解剖后見內部各器官色澤鮮紅,供血情況良好,體脂分布正常,未見器官肌肉萎縮等情況。120 min組,偶爾有氣喘,飲水量和進食量稍增加外,神態和皮毛等無明顯變化。解剖后,發現體脂分布減少外,內臟各器官色澤鮮紅,供血良好,未見器官肌肉萎縮等情況。120 min+負重組的訓練隨著訓練時間的延長神情倦怠、眼神暗淡無光、體毛有部分脫落。解剖可見,體脂分布明顯減少,內臟器官色澤暗紅,供血較差,部分臟器淤腫。三組小鼠中 120min+負重組隨著訓練時間的延長而逐漸不能順利地完成任務,游完后都表現筋疲力盡,而其它兩組的小鼠活動狀態一直較好。

2.2 三組小鼠心肌組織變化的特點 各組小鼠解剖心臟時肉眼觀,呈鮮紅色,彈性好大體無明顯變化,但 120 min+負重組的心室壁較其它兩組的心室壁要肥厚。靜養對照組 HE染色切片在 ×40倍的光鏡下 (圖 1),可見心肌纖維呈短柱狀,分支相互連接成網,境界清楚,胞漿均勻紅染,心肌纖維排列整齊,核大小正常,呈橢圓形位于細胞中央,細胞間質較少,毛細血管形態、分布正常,內皮細胞、基膜無腫脹增厚、無炎性細胞浸潤。120min組 HE染色切片在光鏡下 (圖 2),可見心肌纖維部分增粗,胞核增大,血管腔擴張,無明顯的心肌細胞變性、壞死。而對 120 min+負重組的 HE染色切片進行觀察 (圖 3),發現部分心肌纖維增粗,胞核增大,部分細胞腫大,核周呈空泡樣變,心肌細胞核周隙擴張,核著色淺,細微結構不清,并可見部分毛細血管和小動脈、靜脈淤血,少量炎細胞浸潤,內皮細胞腫脹,腔內紅細胞淤滯。

2.3 三組小鼠的 VEGF染色結果對比 靜養對照組 VEGF表達為陰性,滿視野染色均勻,有散在VEGF的特異性的棕黃染色顆粒 (圖 4);120min組心房肌中可見在細胞間質內有少許的棕黃顆粒,心室肌明顯較少 (圖 5);而在 120m in+負重組中可見心房肌中大量存在有棕黃顆粒,使得滿視野中充滿了棕黃色 (圖 6),120 min組心室肌邊緣部分中可見在細胞間質內只有少許的棕黃顆粒 (圖7);120min+負重組心室肌中細胞間質內有少許的棕黃顆粒 (圖 8)。而心室肌也較心房肌較少。分析其陽性面積比 (陽性面積/視野面積),120 min組和 120 min+負重組均與靜養對照組有明顯性差異,120 min組與 120m in+負重組也有明顯性的差異,如表 1。

表 1 三組小鼠心肌VEGF表達情況

3 討論

運動對心臟心肌的影響一直是運動醫學領域探討的熱點問題,在先前的研究中發現適宜的訓練強度可使心肌的形態結構得到改善,過度訓練可致心肌細胞受損[4]。但目前尚少見通過 VEGF影響來探究心室肌和心房肌的改變。不同負荷的運動訓練是否會對心室肌和心房肌產生不同的影響,是本實驗研究的重點問題。我們選取兩個方面來討論,即體重、心肌中 VEGF表達的狀況。

大量動物實驗研究發現[5],適宜的運動可使心臟肌纖維增粗,心肌結構發生協調性變化,線粒體數量增多,心肌毛細血管增多,運動使心肌蛋白合成增加。而不適宜運動導致心肌受損,突然進行較大強度或衰竭運動導致心肌缺血而出現病理變化。而缺氧是刺激 VEGF表達的重要因素[6]。業已證明,許多組織無論是缺氧還是缺血,VEGFmRNA的表達總是增加。這一現象是否也存在于心臟?國外學者在鼠、豬、狗的不同形式造成的心肌梗死或心肌損傷的動物模型中均發現VEGF的異常表達[7,8]。Banai[9]等還發現,體外培養的心肌細胞缺氧 2～4 h,細胞內的 VEGFmRNA水平增高 6～10倍;而在體內,當心肌缺氧時心肌細胞中 VEGFmRNA水平可以增高 3～5倍。在顯微鏡下看見,部分心房肌肌纖維增粗,胞核增大,部分細胞腫大,核周呈空泡樣變,心房肌肌細胞核周隙擴張,核著色淺,細微結構不清,并可見部分毛細血管和小動脈、靜脈淤血,少量炎性細胞浸潤,內皮細胞腫脹,腔內紅細胞淤滯。但是心室肌則沒有那么的明顯。這說明隨著負荷的加大,機體進一步激活了內皮生長因子,但這是以部分心房肌細胞的損傷作為代價的。

分析其機制,小鼠身體中大部分都有 VEGF分布,心房、心室和瓣膜中也都有 VEGF分布。正常情況下,心房、心室肌細胞低水平表達VEGF,維持一定血管密度和血管對運輸營養物質所必需的通透性。研究發現缺血缺氧均可誘導心肌細胞表達 VEGF增強,而且壞死區周圍明顯高于非壞死區。在運動過程中,心臟的缺血、缺氧現象存在,當運動負荷適當時,心臟的缺血、缺氧并不對心臟造成嚴重損傷,這可能與適宜運動時心房肌組織內抗氧化系統能力提高及適宜運動時心肌組織內毛細血管數量增多,提高冠脈血流量和毛細血管的交換能力有關。而在運動超過了一定量的情況下,心肌細胞自由基增多、鈣超負荷,并發生缺血、缺氧性損傷,毛細血管損傷后密度下降,心房肌肌細胞與間質的膠原間正常比例遭到破壞,心臟由代償性生理肥大向失代償性病理性肥大轉變。本實驗結果顯示在一定量的運動負荷下可以促進心房肌細胞分泌 VEGF,可能是因為運動造成心肌缺血缺氧,從而誘導 VEGF表達增強,這與文獻報道相一致;而 120min+負重組比 120min組心房肌細胞分泌 VEGF更強,可能是因為加大強度負荷運動后心房肌細胞在一定程度上受到損傷,心房肌缺血缺氧,心房肌細胞病變尚不足引起大量分泌 VEGF的緣故或大強度負荷組大鼠對心肌損傷產生適應性改變,這些都會使的 VEGF再次對內皮細胞產生刺激,內皮細胞從而增殖,在體內誘導血管生成。

三組試驗小鼠的心臟,隨著所受負荷的增加,表現出代償到失代償的變化,并且通過免疫組化染色可以推論出心房肌的失代償程度較心室肌更為明顯,這與心室肌更為敏感的傳統觀念相反。可能是心房肌對缺血缺氧較心室肌更為顯著所致。因為不同心肌細胞膜上的離子通道的類型、數量及其開合的條件是不完全一樣的,因而不同心肌細胞的生物電活動也不盡相同。可能是長時間大負荷的游泳對心房肌細胞和自律細胞膜上的離子通道的抑制較大,導致離子通道開啟數量的下降,而對心室肌細胞膜上的離子通道的影響并不顯著,甚至一部分離子通道受長時間的游泳而增強。

以上這些都與心房肌中 VEGF的表達結果相符。在心肌中,缺氧有明顯增加 VEGF表達的作用[10-12]。VEGF是內皮細胞特異性有絲分裂原,具有促進內皮細胞分裂、增殖、遷移,形成新生血管的作用。血管內皮細胞只是 VEGF作用的靶細胞,其本身并不表達 VEGF。VEGFmRNA在心臟中主要位于心肌細胞,低氧促使心肌細胞表達VEGFmRNA、分泌 VEGF蛋白增加,可能是機體的一種代償機制。分泌出的 VEGF蛋白作用于血管內皮細胞膜上的 VEGF受體 Flk-1、Fit-1,通過一系列信號傳導使內皮細胞分裂、增殖、遷移,形成新生血管,建立側支循環,增加缺氧/缺血心肌的氧供/血供,從而減輕或逆轉心肌細胞的受損,改善心功能。不同運動負荷訓練對機體產生不同的影響,有研究表明血管內皮細胞在正常情況下低表達 VEGF,但當內皮細胞被置于缺氧環境時,細胞內 VEGFmRNA水平明顯增加[2],這表明 VEGF不僅通過旁分泌途徑作用于內皮細胞,而且有自分泌機制參與。在本試驗中,120 m in組的小鼠在經過了 8周時間的訓練后小鼠精神狀態、體重、飲食飲水量、大小便等與對照組無明顯負面影響,這表明了心肌細胞在訓練過程當中產生了適應性,同時適宜的運動強度使心肌的代謝和功能處于良好的狀態。這說明心房肌雖然有一定的功能減弱,但是心房肌最終還是功能性增強。在顯微鏡下所見 120 min組心肌細胞處于正常狀態,還有微弱的 VEGF表達,120 min+負重組中可見心房肌中大量存在有棕黃顆粒,這說明細胞內 VEGF mRNA水平明顯增加很有可能也主要在心房肌,此結果為運動心臟的形成和心臟康復提供了可靠的試驗依據。

[1]艾洪濱,祝建平,張學英,等.長時間游泳對小鼠心電活動的影響 [J].山東醫學工程,2003,22(1)：24-27.

[2]步斌.運動負荷與沙棘對大鼠心肌血管內皮生長因子表達影響的研究 [J].成都體育學院學報,2004,30(6)：76-79.

[3]張志琪,田振軍,張小玲.不同運動負荷小鼠心肌活細胞游離鈣動態變化的 LSCM研究 [J].中國運動醫學雜志,2003,(18)1：201-206.

[4]Stuber M,Scheidegger MB,Fischer SE,et al.Alterations in the local myocardial motion pattern in patients suffering from pressure overload due to aortic stenosis[J].Circulation,1999,100(7)：361-368.

[5]曲綿域,于長隆.實用運動醫學 [M].北京：北京大學醫學出版社,2003.179-182.

[6]Liu Y,Cox SR,Morita T,et al.Hyooxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelialcell.Identification of a 5'enhance[J].Circ Res,1995,(77)：638-643.

[7]Sellke FW,Wang SY,Stamler A,et al.Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcinemyocardium[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,1996,271(8)：713.

[8]Yang R,Thomas GR,Bunting S,et al.Effectsofvascular endothelial growth factor on hemodynam icsand cardiac performance[J].JCardiovasc Pharmacol,1996,27：838-844.

[9]Banai S,Shweiki D,Pinson A,et al.Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia：implications for coronary angiogenesis[J].Cardiovasc Res,1994,(28)：1176-1179.

[10]夏云健,時慶德,蔣春筍,等.運動性疲勞狀態下大鼠心肌線粒體氧化磷酸化偶聯的變化 [J].天津體育學院學報,2002,2(19)：19-21.

[11]劉曉莉,蘇美華,喬德才.運動疲勞誘導小鼠心肌細胞氧化應激與 DNA損傷 [J].中國運動醫學雜志,2008,29(5)：621-623.

[12]關鍵,王健平,車笑非,等.缺氧條件對成骨細胞 VEGF和 TGF-β1表達影響的實驗研究 [J].中國修復重建外科雜志,2008,22(8)：984-988.