豬毛蒿精油對玉米象體內4種解毒酶活力的抑制

尚利娜,袁海濱,2,魏春艷,3,任炳忠

(1.東北師范大學生命科學學院,吉林長春130024; 2.吉林農業大學農學院,吉林長春130118; 3.吉林出入境檢驗檢疫局,吉林長春130062)

豬毛蒿精油對玉米象體內4種解毒酶活力的抑制

尚利娜1,袁海濱1,2,魏春艷1,3,任炳忠1

(1.東北師范大學生命科學學院,吉林長春130024; 2.吉林農業大學農學院,吉林長春130118; 3.吉林出入境檢驗檢疫局,吉林長春130062)

植物精油是一種最具潛力的儲糧防護劑,對儲糧害蟲具有多種生物活性并能影響害蟲體內酶活力的變化.采用5種質量分數的豬毛蒿精油(1%,5%,10%,15%,20%)分別處理玉米象2,4,8,12,24 h后,測試了玉米象體內4種解毒酶活力的變化情況.結果表明,經豬毛蒿精油觸殺后,玉米象體內4種解毒酶的活力發生了變化.酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(ALP)和α-乙酸萘酯酶(α-NACarE)活力受到抑制.在低質量分數處理條件下(第Ⅱ至第Ⅳ處理組),谷胱甘肽-S-轉移酶被誘導,活性升高;在高質量分數時(第Ⅴ、第Ⅵ處理組),酶的活性受到抑制.本研究的結果為闡明豬毛蒿精油的殺蟲機理提供了參考.

精油;豬毛蒿;玉米象;酶活力

玉米象是最具破壞性的儲糧害蟲之一,常見于家庭、糧倉和倉庫內的糧食中[1].多年來,利用化學熏蒸劑和防護劑對玉米象進行防治不僅污染環境而且影響糧食的安全;此外,已有報道表明玉米象對多種殺蟲劑,包括磷化氫和馬拉硫磷等都產生了抗藥性[2-5].因此,迫切需要開發和利用安全的儲糧害蟲熏蒸劑和防護劑.

豬毛蒿(A rtemisia scopariaWaldst.et Kitag)隸屬于菊科(Compositae)、蒿屬(A rtemisia),分布于我國各地,容易采收[6].目前已有研究表明從豬毛蒿植株中提取的精油對多種害蟲具有觸殺、熏蒸和種群抑制的作用.其主要成分茵陳二炔高達42.4%[6],對倉庫害蟲如赤擬谷盜 Tribolium castaneum Herbst、谷蠹 Rhizopertha dominica(Fabricius)、黃粉甲 Tenebrio molitorL.和麥蛾 Sitotroga cerealella(Oliver)具有顯著的繁殖抑制、殺卵和忌避作用[7].同時,還發現茵陳二炔對昆蟲具有光活化毒性和酯酶抑制作用[8].但是,對不同質量分數的豬毛蒿精油進入昆蟲體內后,蟲體內解毒酶變化情況的研究還很有限.

植物精油作用于昆蟲的組織和器官中,能夠影響多種解毒酶的活力,如α-乙酸萘酯酶(α-NACarE)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)、酸性磷酸酯酶(ACP)和堿性磷酸酯酶(ALP)等.精油在進入昆蟲體內以后,有些可能被降解而失活,有些可能被活化而增強毒性.這常常是由于不同酶的催化作用,導致這些酶通過增強對精油的轉化和降解作用以降低毒性或通過阻隔作用保護自己的靶標位點,在對外源化合物的解毒代謝和殺蟲劑的抗性機制中起著重要作用.本研究測試了5種質量分數的豬毛蒿精油處理玉米象不同時間后,玉米象體內4種解毒酶的活力,旨在了解豬毛蒿精油對玉米象體內酶活力的抑制情況,初步闡明精油的作用機制.

1 材料和方法

1.1 豬毛蒿精油的提取

供試植物豬毛蒿(A.scoparia)于2008年8月末至9月初采自吉林省長春地區.豬毛蒿精油的提取采用蒸餾的方法:取豬毛蒿的種穗陰干后切碎,加水浸泡12 h,每100 g種穗加水約300 mL,蒸餾2.5～ 3 h,冷凝器中不再有油滴滴出表示蒸餾結束.用棕色玻璃容器收集,密閉,置于4℃冰箱內保存備用.試驗得到的豬毛蒿精油為黃色且具有刺激性氣味的揮發油.

1.2 昆蟲飼養

玉米象Sitophilus zeamais(Motschulsky)采自吉林省長春市.在全黑暗(DD),(30±1)℃,相對濕度65%～70%條件下,以大米飼養.將大米分裝于玻璃罐內,接入玉米象,7 d后篩去成蟲,待新一代成蟲大量出現約一周后,篩出成蟲供試驗用.

1.3 酶源制備

將玉米象置于9 cm培養皿中,每皿接蟲30頭,用微量點滴器將丙酮及用丙酮配置的5種質量分數的精油點滴于玉米象成蟲的背板上,每蟲點滴1μL,重復3次.試驗共計6組,即Ⅰ:對照組;Ⅱ:1%處理組;Ⅲ:5%處理組;Ⅳ:10%處理組;Ⅴ:15%處理組;Ⅵ:20%處理組.分別取對照和不同質量分數的精油處理不同時間(2,4,8,12,24 h)后的玉米象,放入預先滅菌的5 mL玻璃勻漿器中,加入p H值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液2 mL,冰浴勻漿.勻漿液在4℃,12000 r/min條件下離心30 min,取上清液作為酶源.

1.4 磷酸酯酶活力測定

1.4.1 ACP活力測定

參照Bessey的方法[9].反應混合液含有0.2 mol/L醋酸緩沖液(p H=4.6)0.72 mL、30μL酶液、0.0075 mol/L對-硝基磷酸二鈉溶液0.15 mL.將混合液混勻后,在37℃水浴中振蕩30 min,加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液0.6 mL,終止反應.在400 nm處比色.以對-硝基酚為底物作標準曲線.

1.4.2 ALP活力測定

用0.04 mol/L巴比妥鈉-鹽酸溶液(p H=9.6)代替0.2 mol/L的醋酸緩沖液,其他試劑及方法均同ACP活力的測定.

1.5 α-NACarE活力測定

參照Asperen的方法[10].反應混合液中含有10μL酶液、0.04 mol/L磷酸緩沖液(p H=7.0)(內含1×10-7mol毒扁豆堿)3.49 mL、0.0004 mol/Lα-乙酸萘酯液0.5 mL,在37℃水浴中保溫30 min,加入0.5 mL顯色劑(1%固牢藍BB鹽溶液與5%SDS溶液以體積比為2∶5混合),室溫下放置10 min, 600 nm比色.以α-萘酚作標準曲線.試驗重復三次.

1.6 GSTs活力測定

參照Habig的方法[11].反應混合液含有0.1 mL酶液、66 mmol/L磷酸緩沖液(p H=7.0)2.4 mL、50 mmol/L谷光甘肽溶液0.2 mL、0.03 mol/L 1,2-二氯-4-硝基苯溶液50μL,立即混勻.在27℃, 340 nm光源下檢測,測5 min內D(340)值的變化.試驗重復三次.

1.7 蛋白質含量測定

以牛血清白蛋白為標準蛋白,參照Bradford的方法測定[12].反應混合液中含有蛋白試劑3 mL,水0.95 mL,蛋白質提取液50μL.室內靜止10～20 min,595 nm測吸光值.試驗重復三次.

1.8 數據分析

利用SPSS軟件分別對不同處理及時間下,各處理組的磷酸酯酶、α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的活力進行方差分析,各表中同列數據后相同字母表示在0.05水平上差異不顯著.

2 結果與分析

2.1 豬毛蒿精油對ACP活力的影響

豬毛蒿精油對玉米象體內ACP活力的影響結果見表1.與對照組Ⅰ相比,在2,4,8 h時,幾乎所有處理組的ACP活力均受到抑制,且差異顯著;在24 h時,第Ⅱ、第Ⅳ、第Ⅴ處理組的ACP活力顯著降低.24 h后,所有處理組的ACP活力逐漸有所恢復.

表1 豬毛蒿精油對玉米象成蟲ACP活力的影響

2.2 豬毛蒿精油對ALP活力的影響

從表2可以看出,與對照組Ⅰ相比,在8,12 h時各處理組的ALP活力顯著下降;除第Ⅲ處理組,在2 h時,各處理組的ALP活力顯著降低;在4 h時,ALP活力顯著升高;在24 h時,第Ⅱ至第Ⅳ處理組的ALP活力顯著降低.

表2 豬毛蒿精油對玉米象成蟲ALP活力的影響

2.3 豬毛蒿精油對α-NACarE活力的影響

從表3中可以看出,與對照組Ⅰ相比,在2,12,24 h時,各處理組的α-NACarE活力差異顯著;在4 h時,第Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ處理組的α-NACarE活力顯著降低;在8 h時,第Ⅲ至第Ⅵ處理組的α-NACarE活力與對照相比顯著升高.

表3 豬毛蒿精油對玉米象成蟲α-NACarE活力的影響

2.4 豬毛蒿精油對GSTs的影響

從表4中可以看出,與對照組Ⅰ相比,在2 h時,各處理組的 GSTs活力顯著升高;在4 h時,第 Ⅳ至第Ⅵ處理組的GSTs活力顯著降低;在8 h時,除第Ⅱ處理組外,各處理組的GSTs活力顯著升高;在12 h和24 h時,第Ⅱ至第Ⅳ處理組的GSTs活力與對照相比顯著升高.

表4 豬毛蒿精油對玉米象成蟲GSTs活力的影響

3 討論

經豬毛蒿精油觸殺后,玉米象體內4種解毒酶的活性發生了變化.磷酸酯酶和羧酸酯酶是昆蟲體內重要的解毒酶系之一,在對有機磷化合物的解毒作用中起重要的作用.它們代謝能力的增強能夠抵御殺蟲劑的攻擊,在許多害蟲中發現這些酶活性的高低與昆蟲對殺蟲藥劑的敏感性有著密切的關系.許多殺蟲藥劑能夠抑制它們的活性,使其降低對酯類殺蟲藥劑的降解[13].通過對酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶和羧酸酯酶的測試發現,與對照相比,它們活性受到了抑制,這就可能導致蟲體不能將精油代謝,從而引發玉米象的中毒或死亡.

谷胱甘肽-S-轉移酶是昆蟲對殺蟲藥劑代謝中重要的共扼酶系之一,它催化內源性的GSH反應,對底物進行親核共扼代謝,特別是許多有機磷化合物能被谷胱甘肽-S-轉移酶作用解毒[14].通過對谷胱甘肽-S-轉移酶活性的測試發現,在低濃度處理時(第Ⅱ至第Ⅳ處理組),谷胱甘肽-S-轉移酶被誘導表現為活性升高,在高濃度處理時(第Ⅴ至第Ⅵ處理組),谷胱甘肽-S-轉移酶的活性受到抑制.這種變化反映出低濃度的豬毛蒿精油進入蟲體內后,玉米象為了抵抗外源物質,激發了體內谷胱甘肽-S-轉移酶的活力,從而達到解毒的作用;而濃度較高的精油進入玉米象體內后,谷胱甘肽-S-轉移酶的活性受到抑制,這就可能使玉米象的正常解毒代謝受到抑制,使外源有毒物質在蟲體內積累,引起了玉米象的中毒或死亡.

本試驗從蛋白質水平上研究了豬毛蒿精油對玉米象體內4種解毒酶活力的影響,至于酶的變化是在表達量上發生改變還是合成了新的同工酶則需要從分子水平上進行深入的研究.

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(責任編輯:方 林)

Inhibition on the activities of detoxification enzymes inSitophilus zeamais of essential oil extracted fromArtemisia scoparia

SHANG Li-na1,YUAN Hai-bin1,2,WEI Chun-yan1,3,REN Bing-zhong1
(1.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130118,China; 2.Faculty of Agronomy,Jilin Agricultural University,Changchun 130024,China; 3.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Changchun 130062,China)

Plant essential oil which is proposed as one of the most potential stored grains protectant and repellents has better bioactivity against insects and effect enzymes in their body.The activities of detoxification enzymesinSitophihuszeamais(Motschulsky)whichweretreatedwithfive concentrations gradients(1%,5%,10%,15%and 20%)of essential oil extracted fromA rtemisia scopariaWaldst.et Kitag.were measured at 2,4,8,12 and 24 h.The results showed the activities of phosphatase and carboxylesterase were inhibited.At the lower concentration(fromⅡtoⅣtreatment group),the activity of glutathione-S-transferase was induced to increase;at the higher concentration (from ⅤtoⅥtreatment group),the activity of glutathione-S-transferase was inhibited.This study would help to elucidate the insecticidal mechanisms of essential oil.

essential oil;A rtemisia scoparia;Sitophilus zeamais;enzyme activity

Q 965.9[學科代碼]180·5440

A

1000-1832(2010)04-0116-05

2010-04-23

吉林省科技發展計劃項目(20090571,20090262);吉林省發改委資助項目[(2007)1033號];國家質檢總局資助項目(2008IK253);長春市凈月開發區資助項目(2007C010).

尚利娜(1982—),女,博士研究生;通訊作者:任炳忠(1963—),男,博士,教授,博士研究生導師,主要從事昆蟲學研究.