白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶重組蛋白的表達及純化

王一存,蘇全平,槐艷艷,王 麗

(東北師范大學生命科學學院,吉林長春130024)

白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶重組蛋白的表達及純化

王一存,蘇全平,槐艷艷,王 麗

(東北師范大學生命科學學院,吉林長春130024)

以白色念珠菌為實驗材料,利用玻璃珠破碎法、PCR技術克隆白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因,根據基因重組技術構建Sap2原核表達載體,使之表達蛋白并且將目的蛋白純化.將獲得的Sap2蛋白免疫兔子,進行Western blot分析,研究了白色念珠菌天冬酰胺蛋白酶的免疫學原性.

白色念珠菌;Sap2;原核表達載體;Western blot

0 引言

白色念珠菌(Candida albicans)是寄生于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道的正常菌群,一般在正常機體中數量較少,不會引起疾病,但當機體免疫功能下降或正常菌群相互制約作用失調,白色念珠菌會大量繁殖并侵入深層組織,引起系統性白色念珠菌感染[1].

近年來白色念珠菌致病性的研究已取得了很大進展,其中分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinase,Sap)是近年來的研究熱點,Sap產量高的白色念珠菌株對黏膜上皮細胞的粘附性比產量低的菌株高.天冬氨酸蛋白酶家族共包括10個家族成員Sap1～Sap10,分別由10個基因編碼[2-4].在感染進展的不同階段白色念珠菌合成和分泌的Sap類型有所不同,當侵入到機體深部或者血液系統時,合成和分泌的Sap2明顯高于其他成員.Sap2其相對分子量質量為41000,能降解多種人體蛋白,去除宿主的防御屏障作用,有助于白色念珠菌的傳播,還能刺激細胞產生多種細胞因子.

白色念珠菌SAP2基因沒有內含子,本研究利用 PCR方法直接從白色念珠菌基因組中獲得SAP2序列,利用PET-28質粒構建雜合質粒,經誘導表達的蛋白含有組氨酸標簽,可通過鎳柱純化重組蛋白,然后再檢測重組蛋白免疫動物的情況,為下一步研究Sap2的功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

E.coL iDH5α,E.coL iBL21,PET-28,白色念珠菌Candida albicans,均由本實驗室保存.

1.2 主要試劑

限制性內切酶EcoR I/Xho I,T4DNA連接酶,Taq DNA poLymerase購自 Takara公司;dN TP IPTG為Sigma公司產品,咪唑為BBI公司產品.

1.3 實驗方法

1.3.1 白色念珠菌SAP2基因的提取

(1)白色念珠菌DNA的提取.離心收集1.5 mL過夜培養的菌體,將細胞懸浮于50μL STES緩沖液中,向其中加入等體積酸洗過的玻璃珠后每管加入20μL TE,再加入等體積混合的酚-氯仿60μL振蕩1 min.12000 r/min離心5 min,收集上清0℃乙醇沉淀15 min,4℃12000 r/min離心10 min,70%乙醇洗滌干燥15 min,40μL TE溶解,電泳檢驗[5].

(2)PCR獲得目的序列.根據SAP2的序列設計引物,根據PET-28的酶切位點圖譜分析,內側引物上游設計為EcoR I的酶切位點GAATTC,下游設計為Xho I的酶切位點CTCGAG.

外側上游引物:GTTGATTCCTCTTGGTTGA;

外測下游引物:TTTATTCCACCCCTTCATCTTA.

內側上游引物:GCCGGAATTCCAAGCTGTCCCAGTGACTTT;內側下游引物:GCCGCTCGAGGGTCAAGGCA GAAATACTGG.

PCR體系為:第一輪RCR反應體系:ExTaq 12.5μL,外側上下游引物各1μL,白色念珠菌DNA3 μL,超純水7.5μL,依次按以下步驟操作:預變性94℃4 min,94℃1 min,53℃40 s,72℃1.5 min,30個循環,72℃10 min.然后以第一輪PCR的反應產物為模板進行第二輪PCR,反應體系為:ExTaq 12.5 μL,內側上下游引物各1μL,模板2μL,超純水8.5μL,按照相同的條件進行PCR反應,1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗,回收SAP2,并用Eco R I和Xho I雙酶切.

1.3.2 SAP2重組質粒的構建

將PET-28菌種接入LB培養基中,37℃培養過夜,常規方法提取質粒,37℃EcoR I和Xho I雙酶切3 h,1%瓊脂糖凝膠電泳證明酶切完全后,利用膠回收試劑盒回收完全切開的載體[6].

將經過雙酶切的SAP2片段和載體片段以3∶1(體積比)的比例16℃過夜連接,形成SAP2和PET-28重組質粒.

1.3.3 感受態細胞的制備及轉化

(1)感受態細胞的制備.從平板上挑取新活化的 E.coliDH5α單菌落,接種于4 mL LB液體培養基中,37℃條件下100 r/min振蕩培養過夜.取1 mL培養液轉入100 mL LB中,37℃振蕩培養至對數生長期D(600)≈0.5,將培養液轉入50 mL離心管中,冰上放置10 min.4℃條件下,5000 r/min離心10 min,棄上清.加入10 mL冰預冷的0.1 mol/L的CaCl2,用移液槍輕輕吹打,使細胞懸浮.然后4℃, 5000 r/min離心10 min,棄上清.再加入4 mL冰預冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞.將制備的感受態細胞200μL加入50μL甘油,混勻,-80℃保存備用.E.coliBL21感受態細胞以同樣的方法制備并保存.

(2)重組質粒的轉化.將連接產物加入到感受態細胞中,用移液槍輕輕吹打均勻,置于冰上30 min, 42℃水浴熱激1.5 min,冰上放置1～2 min,然后加入800μL的LB培養基,150 r/min,37℃振蕩培養1 h.最后,3000 r/min離心5 min,扔掉部分上清,用移液槍輕輕吹打均勻,使細菌充分懸浮后均勻涂布于含 Kan的篩選平板上.37℃倒置過夜培養.

1.3.4 重組質粒的篩選鑒定

挑單克隆,接種于4 mL LB培養液中100 r/min 37℃過夜培養,次日小量提取質粒,用EcoR I、Xho I酶切后瓊脂糖凝膠電泳,初步鑒定為陽性克隆.篩選的陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序.

1.3.5 SAP2基因的誘導表達

用測序正確的重組質粒轉化 E.coliBL21.挑取單克隆保存菌液,并進行重組蛋白的表達.取20μL菌種,加入含100μg/mL Kan 4 mL的LB培養基中,100 r/min 37℃過夜培養,以1∶100的比例(體積比)將上述菌液加入到含100μg/mL Kan的LB培養基中,200 r/min培養3 h,搖菌至D(600)≈1.0,加入IPTG至終濃度1 mmol/L分別誘導表達5 h.8000 r/min離心10 min,收集菌體,按照每毫升菌體加25μL 1×PBS進行懸浮后SDS-PAGE電泳.考馬斯亮蘭染色以鑒定目的蛋白是否表達.

1.3.6 Sap2蛋白的提取純化

將20 mmol/L PBS溶解菌體沉淀后,冰浴中超聲波破碎.將細菌破碎液以9000 r/min高速離心20 min,分別收集沉淀和上清液,SDS-PA GE電泳檢驗目的蛋白存在于上清還是沉淀中.

8 mol/L尿素溶解沉淀,過夜,9000 r/min離心20 min,10 mL PBS洗鎳柱,鎳柱純化蛋白時取上清過柱,依次用20,40,100,200,500 mmol/L咪唑洗脫液5 mL洗脫并收集洗脫液,然后SDS-PAGE電泳檢驗,處理鎳柱子使其再生.將獲得的蛋白洗脫液加入到透析袋中,分別用6 mol/L尿素2 h,4 mol/L尿素2 h,2 mol/L尿素2 h,PBS 2 h進行梯度透析.硅膠干燥濃縮.

1.3.7 Western blot鑒定Sap2的免疫原性

取健康兔子血清作為陰性對照后進行兩次免疫,第一次注射1 mg Sap2蛋白,兩周后第二次注射0.5 mg Sap2蛋白,以免疫后的兔血清作為材料進行Western blot檢驗.20μg Sap210%聚丙烯酰胺凝膠電泳,80 V電轉移3 h至PVDF上,印跡膜用5%(體積分數)脫脂牛奶4℃封閉過夜;1∶100(體積比)稀釋的兔血清37℃孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min;1∶1000(體積比)稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,AEC顯色.

2 結果

2.1 白色念珠菌總DNA的鑒定

提取純凈的白色念珠菌總DNA是合成高質量SAP2的關鍵因素.1%瓊脂糖凝膠電泳證明,提取的白色念珠菌DNA質量較好,具有單一的目的條帶,未見其他雜DNA污染條帶.紫外分光光度計分析表明DNA的純度較高,結果見圖1.

圖1 白色念珠菌的總DNA電泳圖

圖2 SAP2DNA片段PCR擴增產物電泳圖

2.2 SAP2 PCR擴增產物的鑒定

SAP2的引物在內側引物下游添加Xho I的酶切位點CTCGAG,上游添加EcoR I的酶切位點GAATTC,以利于其正確插入載體.利用設計的引物進行巢式PCR,PCR擴增產物的電泳結果表明在1000 bp附近有一條帶,片段大小與預計結果相符,見圖2.

2.3 PET-28-SAP2重組質粒的構建與鑒定

PET-28序列有EcoR I的酶切位點GAATTC和Xho I的酶切位點CTCGAG.將獲得的SAP2插入載體中,用此連接產物轉化 E.coL iDH5α菌,挑取菌落將菌落擴增后提取質粒,經過EcoR I、Xho I雙酶切鑒定,結果與預測相符.

瓊脂糖凝膠電泳可見兩條帶,小片段在1000 bp附近,與SAP2的PCR產物位置相同,與預期的白色念珠菌SAP2基因片段大小一致.測序表明,原核表達質粒PET-28-SAP2構建正確,見圖3.

圖3 PET-28-SAP2雙酶切鑒定電泳圖

2.4 Sap2蛋白的表達及鑒定

原核表達質粒PET-28-SAP2轉化BL21后,37℃條件下經IPTG誘導表達、SDS-PAGE電泳、考馬斯亮蘭染色后發現在轉化PET-28-SAP2的細菌表達的蛋白電泳中出現一條明顯的條帶.SAP2目的蛋白的相對分子質量約為41000,融合蛋白的相對分子質量應該為41000左右,41000對應的位置有與預期結果相符的條帶,表明融合蛋白表達成功.分別誘導1,2,3,4,5,6 h后收集菌體,經過SDS-PAGE電泳可見誘導5 h蛋白表達量最高;分別以0,0.2,0.4,0.6,0.8,1 mmol/L IPTG誘導表達5 h,確定最佳誘導濃度為0.8 mmol/L,見圖4.

2.5 Sap2蛋白的純化

將超聲破碎后的裂解液離心,分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析,結果證明沉淀中含有重組蛋白.所以重組蛋白是以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在的.

采用10倍鎳柱床體積的20 mmol/L咪唑洗柱,用20 mmol/L PBS配制的20,40,100,200,500 mmol/L咪唑洗脫液梯度洗脫,以獲得純度較高的融合蛋白.在100和200 mmol/L咪唑洗脫時獲得純度較高的蛋白,見圖5.

圖5 純化Sap2蛋白電泳圖

2.6 Werstern blot鑒定Sap2的免疫原性

AEC顯色可見免疫后的血清組在相應的蛋白條帶位置出現了明顯的棕黃色條帶,而陰性對照組卻未出現條帶.Western blot結果表明,Sap2可刺激兔子產生特異的免疫反應,見圖6.

圖6 Werstern blot鑒定Sap2免疫原性圖

3 討論

免疫抑制劑、廣譜抗生素、抗腫瘤藥物的應用及各種器官移植手術導致臨床真菌感染的發病趨勢發展迅速,而念珠菌是最常見條件致病真菌,其中白色念珠菌致病性最強、感染率最高,已經成為威脅患者生命安全的重要因素.因此對于系統性白色念珠菌感染的檢測以及疫苗和抗真菌治療的研究有很高的應用價值[7].目前真菌疫苗的研究已經取得了一定的進展,其中重組亞單位或者表位疫苗DNA是白色念珠菌疫苗研究的重點.但目前缺乏有效的早期診斷和防治手段,該病仍具有較高的發病率和病死率.

本實驗在前期工作的基礎上,利用巢式PCR從白色念珠菌DNA中克隆了SAP2序列,在引物中設計了不同的酶切位點可以使目的基因順利插入到載體中.從而構建了能夠表達蛋白的表達質粒PET-28-SAP2,重組質粒可在宿主菌中高效表達目的蛋白.在克隆過程中,將構建好的PET-28-SAP2轉入E.coliBL21,經過不同時間的誘導表達后,我們初步確定Sap2蛋白誘導表達的最適條件為:IPTG誘導5 h.目的蛋白可以在非變性的條件下用鎳柱純化,而以包涵體形式表達的蛋白需在尿素溶解后復性才能用鎳柱純化,經純化可以得到大量的純度較高的Sap2蛋白,為進一步研究Sap2蛋白的生物學特性、免疫原性及其在白色念珠菌感染診斷和疫苗開發中的應用奠定了基礎[8].

經過Western blot驗證我們得到的純度較高的Sap2蛋白具有免疫原性,免疫的兔子血清中產生了抗體,這樣就可以純化血清中的抗體用于免疫治療以及白色念珠菌感染的早期診斷研究.

[1] 王麗,朱筱娟.白色念珠菌熱休克蛋白90[J].科學通報,1999,44(23):2476-2480.

[2] YANG QIONG,WANG LI,LU DA-NING,et al.Prophylactic vaccination with phage-displayed epitope ofC.albicanselicits protective immune responses against systemic candidiasis in C57BL/6 mice[J].Vaccine,2005,23(31):4088-4097.

[3] MONOD M,HUBE B,HESS D,et al.Differential regulation of SAP8 and SAP9,which encode two new members of the secreted aspartic proteinase family inCandida albicans.[J].Microbiology,1998,144:2731-2737.

[4] MORRISON C J,HURST S F,REISS E.Competitive binding inhibition enzyme-linked immunosorbent assay that uses the secreted aspartyl proteinase ofCandida albicansas an antigenic marker for diagnosis of disseminated candidiasis.[J].Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(5):835-848.

[5] 楊瓊,王麗.系統性白色念珠菌感染小鼠動物模型的研究[J].東北師大學報:自然科學板,2005,37(2)86-89.

[6] 盧圣棟.現代分子生物學實驗技術[M].北京:中國協和醫科大學出版社,1999:319-327.

[7] 楊瓊,蘇全平,溫得中,等.系統性白色念珠菌感染的免疫應答反應及疫苗研究進展[J].生理科學進展.2006.37(3):259-262.

[8] 楊瓊,蘇全平,溫得中,等.展示白色念珠菌HSP90的雜合噬菌體誘導C57BL/6J小鼠產生的體液免疫應答反應[J].東北師大學報:自然科學版,2006,38(4):106-109.

(責任編輯:方 林)

Expression and pruification of protein Sap2 inE.coiL

WANG Yi-cun,SU Quan-ping,HUAI Yan-yan,WANG Li
(School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

Total DNA was isolated fromCandida albicans,their DNA fragment of SAP2 gene were gained by nested PCR.The highly conserved co-chaperone for SAP2 was cloned into a bacterial experssion vetor PET-28.And the Sap2 protein was produced inE.colicells when it was induced by IPTG.The protein would be verified by SDS-PAGE,purified by Ni-NTA,the expressed proteins were easily purified,Sap2 can be used to show antigenicity in animal immunization

Candida albicans;Sap2;prokaryotic expression vector;Western blot

R 392.11[學科代碼]180·37

A

1000-1832(2010)04-0111-05

2010-03-21

國家自然科學基金資助項目(30872365);吉林省科技發展計劃項目(20080939).

王一存(1985—),女,碩士研究生;王麗(1957—),女,博士,教授,博士研究生導師,主要從事細胞生物工程研究.