PEPCK不同啟動子調控報告基因表達效率的比較

王學斌，馮潔，楊玉琴，謝建云，陳國宏

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009;2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監督檢驗站，上海 201203;3.復旦大學，上海 200032)

綜述·進展

研究報告

PEPCK不同啟動子調控報告基因表達效率的比較

王學斌1，馮潔2，楊玉琴3，謝建云2，陳國宏1

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009;2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監督檢驗站，上海 201203;3.復旦大學，上海 200032)

目的構建兩種不同的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因啟動子調控報告基因表達質粒，比較該啟動子在各種細胞系中的表達效率。方法采用PCR克隆大鼠PEPCK啟動子1323 bp和560 bp兩條片段，將兩個PEPCK啟動子片段插入pGL4.26－Luc2報告質粒中，將重組質粒轉染到肝臟細胞系和脂肪細胞系，以非脂肪或肝臟細胞系做對照，比較PEPCK驅動熒光素酶表達效率。結果通過酶切鑒定及基因測序，證明pGL4.26－PEPCK－Luc2熒光素酶表達質粒構建成功，且能夠在體外表達熒光素酶。結論兩種同片段的PEPCK啟動子在各細胞系中的表達效率差異無顯著性。

重組質粒;表達效率;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)能催化草酰乙酸(oxaloacetate，OAA)轉化為磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，是體內糖異生作用中第一個關鍵酶，其調節主要在轉錄及轉錄后水平。PEPCK基因在肝、腎、褐色脂肪和白色脂肪中高表達［1］。其表達受多種激素和第二信使的轉錄水平調節，其中包括胰島素、糖皮質激素、維甲酸、甲狀腺素、環磷脂酸腺苷［2］。PEPCK基因轉錄的組織特異性是由激素和飲食調控的。例如:PEPCK在肝臟中的表達和血糖濃度有關，在腎臟中的表達主要受體質的酸/堿比例調控。在肝臟和腎臟中，糖皮質激素刺激其表達，而環磷酸腺苷和胰島素抑制其表達。在脂肪組織中，糖皮質激素則抑制其表達。

轉錄調控的復雜性使PEPCK基因成為研究激素相關和基因表達組織特異性的有力模型，目前國際上已經研究出包括PEPCK啟動子區域－888～+ 69序列構建的載體可以在肝、腎和小腸中特異性表達并且受激素和飲食的調控。然而PEPCK啟動子區域在脂肪組織中特異性表達的報道則極少，Jerry等在1999年利用轉基因小鼠證明PEPCK啟動子區域－1242～828為脂肪特異的增強子，這個增強子可作為PEPCK在脂肪中特異表達的啟動子［3］。所以我們選定PEPCK啟動子區域－1254～+69作為在脂肪中的特異表達啟動子，采用熒光素酶表達系統，構建PEPCK－1254～+69啟動子調控的熒光素酶表達質粒，同時構建PEPCK－488～+69核心啟動子區域調控的熒光素酶表達質粒作為對照［4］。將構建好的載體轉染到肝臟細胞系和脂肪細胞系，以非脂肪或肝臟細胞系做對照，比較PEPCK驅動熒光素酶表達效率。

1 材料和方法

1.1 細胞株和載體

BRL－3A大鼠肝細胞株、3T3－L1脂肪前體細胞株購于中科院生化細胞所。HEK－293細胞株、SHSY5Y細胞株BMC細胞株、pGL4.26－Luc2(連接熒光素酶報告基因Luciferase)、PCDNA3.1－Luc2為華東師范大學腦功能基因組研究所保存。pMD18－T載體購于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

本實驗克隆所用的內切酶、T4連接酶、高保真Taq酶、Trizol、RT－PCR試劑盒均購自TaKaRa公司; M1640培養基、DMEM培養基、MEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司;Lipofectin2000購自Invitrogen公司;熒光素酶測定試劑盒購自Promega公司。

1.3 pGL4.26-PEPCK-Luc2載體的構建

以大鼠基因組DNA為模版，在PEPCK啟動子－488～+69設計引物:

同時在PEPCK啟動子－1254～+69設計引物:

經PCR擴增，回收產物大小為560 bp和1323 bp的片段，回收PCR產物鏈接到pMD18－T載體中，測序。利用pMD－18T載體上Kpn I位點和PEPCK啟動子3′端Bgl II位點進行雙酶切，同時用上述兩個酶雙切pGL4.26，酶切產物回收、鏈接、轉化、克隆篩選得到pGL4.26－PEPCK－Luc2載體。

1.4 pGL4.26-PEPCK-Luc2載體熒光素酶表達活性的鑒定

用脂質體轉染法將重組質粒pGL4.26－PEPCKLuc2分別轉染BRL－3A、3T3－L1、SHSY5Y、293、MBMC細胞株。為了驗證脂質體轉染的最佳轉染效率，脂質體與質粒的比例分別為1∶0.5、1∶2.5和1∶5。具體步驟為:①將密度為2.5×105的細胞接種到96孔板，待細胞融合到90%～95%。②25 μL Opti－MEM分別稀釋質粒和0.4 μL的脂質體，室溫放置5 min。③稀釋好的脂質體和質粒混勻，室溫放置20 min。④混合液加入到含100 μL Opti－MEM培養基的細胞孔中于37℃、5%CO2條件下培養6 h后換含血清的培養液繼續培養24 h。

1.5 熒光素酶活性的測定

轉染24 h后，各細胞孔加100 μL熒光素酶裂解液，以含有CMV啟動子的PCDNA－Luc2做為熒光素酶表達效率對照，三種比例的的轉染液比較轉染效率，在酶標儀上測定熒光素酶的活性。所有的實驗數據都取4個樣品的平均值，每個實驗重復2次。

2 結果

2.1 PEPCK啟動子PCR擴增結果

由PCR擴增產物電泳圖可以看出，兩對引物分別在預期的560 bp和1323 bp處出現明顯DNA片段(圖1)，無明顯非特異性條帶。PEPCK啟動子與pMD18－T載體連接，連接產物經DH5a轉化之后，克隆后經酶切鑒定條帶與預計條帶大小相符，測序結果經Blast對比與大鼠PEPCK基因序列完全相符。

2.2 含PEPCK啟動子熒光素酶報告基因質粒的酶切鑒定及測序

1:長片段PEPCK PCR產物;3、4:短片段PEPCK PCR產物;M:DL2000 marker;2、5:空白對照圖1長、短兩個段片段PEPCK擴增結果Note:1:PEPCK－long fragment product;2，4:PEPCK－short fragment product;M:DL2000 marker;2，5: Negative controlFig.1 The results of PCR amplification of the genom ic DNA of PEPCK long and short fragments

重組質粒經轉化后挑取克隆經過酶切鑒定(圖2)。測序結果經Blast對比證實完全正確。說明含PEPCK啟動子熒光素酶報告基因質粒構建成功。

1:長片段的PEPCK重組質粒;2:短片段的PEPCK重組質粒;3: Kpn I+Bgl II酶切pGL4－PEPCK－short;5:Kpn I+Bg lII酶切pGL4－PEPCK－long;M:DL2000 marker;4、6:空白對照圖2兩種pGL4－PEPCK－Luc2質粒的酶切鑒定Note:1:pGL4－PEPCK－long;2:pGL4－PEPCK－short;M:DNA maker (DL2000);3:pGL4－PEPCK－short digested with Kpn I+Bgl II;5: pGL4－PEPCK－long digested with Kpn I+Bgl II;4，6:Negative control.Fig.2 Identification of the recombinant pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short by restriction enzyme digestion

2.3 轉染細胞轉染效率和熒光素酶活性的測定

重組質粒pGL4－PEPCK－Luc2分別瞬時轉染脂肪前體細胞系3T3－L1和大鼠肝細胞系BRL－3A，用非脂肪細胞和非肝臟細胞系SHSY5Y、293、MBMC細胞系作為對照，比較PEPCK驅動熒光素酶表達效率。以強啟動子CMV作為PEPCK啟動子效率表達的對照組，為了驗證脂質體轉染的最佳轉染效率，脂質體與質粒的比例分別為1∶0.5、1∶2.5和1∶5。結果CMV啟動子的轉染效率在各種細胞系都是脂質體與質粒比例為1∶2.5時最高。長、短兩個片段的PEPCK啟動子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC細胞系中在1∶2.5時轉染效率最高，在其他兩個細胞系中以1∶0.5時轉染效率最高。從圖3可以看出，以CMV為對照的兩個PEPCK啟動子表達效率，在肝細胞系BRL－3A中表達效率最高，在HEK－293細胞系中表達最低。短片段的PEPCK啟動子在各細胞系中表達都比長片段的表達效率要高，只有在HEK－293細胞系中長片段表達效率高于短片段啟動子，且存在顯著性差異。

圖3 不同PEPCK啟動子轉染各細胞系后表達效率比較(%)Fig.3 Comparison of the expression efficiency in different cell lines after pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short transfection.*P＜0.05: compared with pCMV－luc2

3 討論

對于PEPCK基因啟動子區域的轉錄調節因子，國內外已經做了很細致的研究，在PEPCK啟動子－1000～+1區域可分為四個功能區［5］:區域一包括TATA盒、CAAT盒區域和環磷酸腺苷調節元件(CRE)的啟動子區域。區域二包括肝細胞核因子－1 (HNF－1)結合位點、CAAT/增強子結合蛋白(C/ EBP)結合區域和甲狀腺素調節元件(TRE);區域三由一個皮質激素調節單位(GRU)組成，包括兩個糖皮質激素調節(GRE)元件，一個胰島素調節元件(IRE)，一個維甲酸受體(RARE)結合區域和兩個肝細胞核因子(HNF)3輔助因子(AF)結合區域;區域四一直延伸到啟動子區域－1000包括兩個過氧化物酶激活受體γ2(PPARγ2)結合位點在－451～－439和－999～－987區域。后者的結合位點是PEPCK基因在脂肪組織中特異性表達結合位點［6］。

目前研究PEPCK基因多借助靈敏度及重復性較好的熒光素酶報告系統取代以同位素作為測定標識、檢測時間長、分析靈敏度不高的氯霉素乙酰轉移酶報告系統［7］。本研究通過對重組pGL4.26－PEPCK－Luc2酶切鑒定、測序鑒定以及在細胞內瞬時表達表明成功構建PEPCK兩個不同啟動子片段的熒光素酶表達質粒。其中PEPCK基因的調控元件多位于560 bp短片段啟動子區域，為PEPCK基因的核心啟動子區域，長片段的啟動子區域在此基礎上延伸到－1254 bp，包含兩個過氧化物酶激活受體γ2((PPARγ2)結合位點，而這兩個位點是正是PEPCK基因在脂肪組織中特異性表達結合位點［6］。將這兩個質粒用脂質體瞬時轉染肝細胞系BRL－3A和脂肪前體細胞系3T3－L1，用非脂肪和非肝臟細胞系SHSY5Y、HEK－293、MBMC作為對照。在肝臟細胞系BRL－3A中，兩個PEPCK啟動子片段的表達效率高于其他細胞系。長、短兩個片段的PEPCK啟動子區域在脂肪前體細胞系3T3－L1系中表達效率沒有顯著性差異。在各種細胞系中560 bp短片段啟動子區域要比1336 bp長片段啟動子區域表達稍高，但沒有顯著性差異。說明在調控過程中是－488～+69約560 bp的短片段啟動子其主要調控作用，并且有文獻報道PEPCK啟動子調控載體在各組織的特異性表達受飲食和激素的調控，這也可能是表達效率沒有顯著性差異的原因之一。不過在HEK－293細胞系中長片段啟動子區域表達高于短片段，且有顯著性差異。同時鑒定脂質體轉染法不同比例下的轉染效率得出長、短兩個片段的PEPCK啟動子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC細胞系中在1∶2.5時轉染效率最高，在其他兩個細胞系中以1∶0.5轉染效率最高，實驗結果差異可能與細胞系、培養條件及細胞狀態的不同有關。

目前國際上對PEPCK啟動子在肝臟、腎、小腸中特異性表達有了詳盡的報道，而在脂肪組織中特異性表達的PEPCK啟動子序列的報道很少。對于在脂肪組織中特異表達的PEPCK啟動子區域還不確定，Eisenberger等［8］在1992年將大鼠PEPCK基因5′端2.2 kb的序列轉入小鼠，發現在－2086～ 888這段序列在脂肪組織中表達。Jerry等在1999年利用轉基因小鼠證明PEPCK啟動子區域－1242～828為脂肪特異的增強子［3］。本研究就是選定PEPCK啟動子的－1254～+69區域1 336 bp和－488～+69區域約560 bp的調控序列，采用熒光素酶報告系統比較PEPCK不同啟動子調控報告基因表達效率，實驗證明PEPCK啟動子的－1254～+69和－488～+69這兩段序列可調控報告基因表達，但表達效率沒有顯著性差異。

［1］JD.Horton，I.Shimomura，MS.Brown，et al.Activation of cholesterol synthesis in preference to fatty acid synthesis in liver and adipose tissue of transgenic mice overproducing sterol regulatory element－binding protein－2［J］.J Clin Invest，1998，101:2331－2339.

［2］Giralt M，Park EA，Gurney AL.Identification of a thyroid hormone response element in the phosphoenolpyruvate carboxykinase(GTP)gene.Evidence for synergistic interaction between thyroid hormone and cAMP cis－regulatory elements［J］. Biol Chem，1991，266:21991－21996.

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［4］Waltner－Law M，Duong DT，Daniels MC，et al.Elements of the glucocorticoid and retinoic acid response units are involved in cAMP－mediated expression of the PEPCK gene［J］.Biol Chem，2003，278(12):10427－10435.

［5］Nizielski SE，Lechner PS，Croniger CM，et al.Animal models for studying the genetic basis of metabolic regulation［J］.J Nutr，1996，126:2697－2708.

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Com parison of the Expression Efficiency of Two Different Recom binant Firefly Luciferase Reporter Plasm ids pGL4-PEPCK-Luc2

WANG Xue－bin1，FENG Jie2，YANG Yu－qin3，XIE Jian－yun2，CHEN Guo－hong1
(1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China; 2.Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals，Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203，China;3.Fudan University，Shanghai 200032，China)

ObjectiveTo construct two different luciferase reporter p lasmid pGL4.26－PEPCK－Luc2，and to evaluate the expression efficiency of the phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)gene promoters in several cell lines in vitro.M ethods Two PEPCK promoter fragments 1323 bp and 560 bp were obtained from rat genomic DNA by PCR，and the fragments were inserted in pGL4.26－Luc2 luciferase reporter plasmid.Then the recombinant plasmid was transfected into hepatoma and adipocyte cell lines to compare the PEPCK driven luciferase expression efficiency.Results

Restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing conformed that the coupling site of the recombinant was correct without base mutation and deletion.The luciferase was expressed in the cell lines transfected with different plasmids pGL4. 26－PEPCK－Luc2.ConlusionThe expression efficiency of the two different PEPCK promoters in various cell lines has no significant difference.

Recombinant plasmid;Expression efficiency;Phosphoenolpyruvate carboxykinase

R349.64

A

1005－4847(2010)03－0225－04

2009－09－18

綜述·進展

上海市科學基因資助項目(071409001)。

王學斌(1985－)，男，碩士，研究方向，特種經濟動物飼養。E－mail:mars8001)558@126.com

謝建云(1968－)，女，研究員，主要從事實驗動物遺傳學研究。E－mail:xiejianyun@hotmail.com