舒必利與垂體移植誘發小鼠子宮腺肌病的比較

饒妍妍，項雙衛

(福建醫科大學附屬協和醫院，福州 350001)

研究報告

舒必利與垂體移植誘發小鼠子宮腺肌病的比較

饒妍妍，項雙衛

(福建醫科大學附屬協和醫院，福州 350001)

目的比較舒必利誘導和垂體移植誘導兩種造模方法的效果，評價適用于子宮腺肌病研究的小鼠模型。方法45只7周齡未曾受孕的雌性BALB/c小鼠，隨機分為對照組、舒必利組和垂體移植組，每組15只。舒必利組每日皮下注射舒必利，每20 g體重注射800 μg，垂體移植組則將同種同齡雄鼠的垂體放入雌鼠右側子宮內，對照組不予任何處理。5個月后以子宮濕重、終末體重、子宮濕重/終末體重的比值、卵巢濕重、子宮HE染色評分及模型成功率等指標評價造模效果。結果5個月后舒必利組和垂體移植組小鼠的子宮濕重、子宮濕重/終末體重的比值、子宮HE染色評分及成功率均顯著高于對照組，但兩模型組各項指標比較差別無統計學意義，三組小鼠終末體重和卵巢濕重比較差別均無統計學意義。結論對照組無一例形成子宮腺肌病，舒必利誘導和垂體移植誘導兩種造模方法均可引起小鼠子宮腺肌病，造模的各項評價指標均無顯著差異，都可用于子宮腺肌病的研究。

子宮腺肌病;小鼠;模型，動物;垂體移植

在子宮腺肌病的基礎研究中，動物實驗占有重要地位，建立穩定可行的動物模型是科學研究的基礎，建立子宮腺肌病動物模型的方法主要有“藥物誘導法”和“手術誘導法”。國外常把SHN小鼠作為研究子宮腺肌病的動物模型，但是該品種尚未引進國內，這是國內關于子宮腺肌病動物研究相對滯后的原因之一。BALB/c小鼠是目前國內外有報道用于研究子宮腺肌病的模型動物［1，2］，本研究采用BALB/c小鼠對舒必利誘導與垂體移植誘導兩種造模方法的效果進行比較分析。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組:清潔級未曾受孕的7周齡雌性BALB/c小鼠45只，體質量(19.45±0.66)g，來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK (滬)2007－2005］，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。隨機分為舒必利組、垂體移植組和對照組，每組15只。7周齡雄性BALB/c小鼠15只，體質量(18.65±0.41)g(來源同雌性BALB/c小鼠)。恒溫清潔環境飼養，小鼠自由攝食和飲水，光照為明/暗每12 h交替。

1.1.2 實驗所需藥品和手術器械:生理鹽水、舒必利注射液(福建省精神衛生中心，批號H43020575)、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、碘伏、無菌小手術器械一套、注射器、小鼠固定板、眼科縫合針線。

1.2 方法

1.2.1 模型建立:①舒必利組:雌性BALB/c小鼠適應性飼養1周后，每日皮下注射舒必利，每20 g體重注射800 μg，1日的量分2次于9 AM和3 PM溶解于0.1m L生理鹽水中注射，共5個月后處死。②垂體移植組:雌性BALB/c小鼠7周齡時子宮發育明顯粗大，有利于進行垂體移植手術。小鼠適應性飼養1周后，無菌條件下，用10%水合氯醛(0.3 m L/100 g)腹腔注射麻醉，固定小鼠四肢及頭部于鼠板上;腹部脫毛，常規消毒皮膚，于下腹正中尿道上約0.5～1cm處縱向切開，分離右側子宮，在距離兩子宮連接部0.5 cm處剪一小口。同時脫頸處死一只同種同齡雄鼠，開顱取出腦垂體，將垂體從小切口處放入右側子宮腔，用眼科鑷將垂體輕輕推至子宮末端(近卵巢處)，小切口無需縫合，將子宮放回腹腔內，常規間斷縫合關腹。垂體移植術后5個月處死。③對照組:不予任何處理，在相同環境中正常飼養，5個月后處死。

1.2.2 觀察指標

(1)一般觀察:實驗期間觀察每組小鼠的飼料攝入量和體重增加情況。實驗結束時，每組小鼠稱重后引頸處死，取出子宮和卵巢，去凈周圍脂肪組織，分別稱重，計算子宮濕重/終末體重的比值，并加以比較，將子宮置于20倍放大鏡下仔細觀察其外觀變化。

(2)病理組織形態學觀察:據文獻報道垂體移植側(右側子宮)子宮腺肌病的發病速度更快且病變程度嚴重，因此本文統一取右側子宮作為研究對象。將右側子宮和卵巢放入4%多聚甲醛中固定，脫水，透明、浸蠟、包埋，制成蠟塊。在切片機上切成7 μm的薄片，HE染色檢查，觀察子宮內膜組織侵入肌層的程度，按照Mori和Nagasawa［3］的評分標準進行評分。評分標準為0級:正常子宮;1級:子宮內膜間質侵入肌肉內層;2級:子宮內膜間質和腺體侵入肌肉內層;3級:子宮內膜組織侵入內外肌層交界處;4級:子宮內膜腺體囊性增生并出現漿膜下結節。每只小鼠子宮取4個以上橫斷面，按照侵入程度分級取平均值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 一般觀察

垂體移植組小鼠術中因麻醉意外死亡1只，其余活動正常。舒必利組小鼠健康無死亡，每日皮下注射后活動減少，半小時后進入睡眠狀態。實驗期間各組小鼠飼料攝入量和體重增加情況無明顯差別。實驗結束時，舒必利組與垂體移植組小鼠肉眼觀子宮呈暗紅色，明顯充血，增粗，局部膨大，但均未見子宮表面腺肌病結節。對照組小鼠子宮呈淡紅色，表面光滑，較細，粗細均勻，未見子宮腺肌病結節。經單因素方差分析檢驗，各組小鼠子宮濕重與子宮濕重/終末體重之間差異有統計學意義(子宮濕重F=22.92，P＜0.05;子宮濕重/終末體重F= 176.32，P＜0.05)，舒必利組與垂體移植組均顯著高于對照組(P＜0.05)，但前兩者之間差別無統計學意義(P＞0.05)，各組小鼠終末體重和卵巢濕重差異無統計學意義(終末體重F=2.921，P= 0.065;卵巢濕重F=3.635，P=0.035)(詳見表1)。

2.2 病理組織學檢查

經顯微組織切片HE染色證實(見圖1，彩插8)，舒必利組12只(80.0%)小鼠成功誘發子宮腺肌病形成，垂體移植組13只(86.67%)小鼠成功誘發子宮腺肌病形成。對照組15只均未發現子宮腺肌病形成。子宮腺肌病發病率和HE染色評分各組間差異有統計學意義(發病率χ2=28.260，P＜0.05;HE染色評分F=210.135，P＜0.05)。發病率用χ2分割法進行兩兩比較，舒必利組與垂體移植組差異無顯著性(P=1.00)，舒必利組與垂體移植組均明顯高于對照組(P＜0.05)。HE染色評分采用S－N－K法進行兩兩比較，舒必利組與垂體移植組差異無顯著性(P＞0.05)，舒必利組與垂體移植組顯著高于對照組(P＜0.05)，詳見表1。

表1 各組對子宮腺肌病的影響(±s，n=15)Tab.1 The impact of modeling methods on adenomyosis in each group(±s，n=15)

表1 各組對子宮腺肌病的影響(±s，n=15)Tab.1 The impact of modeling methods on adenomyosis in each group(±s，n=15)

注:與對照組比較:★P＜0.05;與舒必利組比較:▲P＞0.05Note:n=15.Compared with the control group:★P＜0.05;Compared with the sulpiride group:▲P＞0.05

分組Group子宮濕重(mg) Uterine wet weight終末體重(g) Body weight子宮濕重/終末體重Ratio of uterine wet weight/body weight卵巢濕重(mg) Ovarian wet weight HE染色評分Scores of HE stained uterine發病率(%) Disease incidence對照組Control 56.27±9.91 26.88±1.20 2.09±0.36 12.64±0.86 0.00±0.00 0.00舒必利組Sulpiride 91.68±1.60★26.14±1.21 3.51±0.16★13.57±2.79 2.60±0.51★80.00★垂體移植組Pituitary transplantation 92.39±1.39★▲25.98±0.80 3.56±0.36★▲11.86±0.74 2.67±0.49★▲86.67★▲

3 討論

子宮腺肌病是指子宮內膜侵入子宮肌層的一種良性病變，病變未超出子宮體范圍，是一種婦科常見病，其發病率近年來呈上升趨勢，且有年輕化傾向。是引起痛經和月經過多的主要原因之一，但病因和發病機制尚不清楚。在人體中很難進行對照研究，因此限制了子宮腺肌病的研究進展。建立合適的動物模型對該病的發生、發展、治療及預防等研究起重要作用。

目前小鼠是子宮腺肌病研究中使用最多的模型動物。小鼠性成熟早(6～7周齡)，性周期短(4～5 d)，生長繁殖快，易于控制。有關子宮腺肌病動物模型的造模方法，大致分為藥物誘導法和手術誘導法。通過干預可明顯縮短小鼠子宮腺肌病的發病時間，加重發病程度。藥物誘導常用多巴胺－2受體抑制劑(舒必利、奮乃靜與滅吐靈)、雌激素、孕激素、雌激素聯合孕激素和催乳素等，據報道雌激素誘導子宮腺肌病動物模型常常并發子宮內膜異常增生和子宮內膜癌，不做為研究腺肌病的理想模型，因此本實驗采用舒必利(多巴胺－2受體抑制劑)誘導法。手術誘導法包括將異體垂體移植至子宮腔誘發子宮腺肌病和將異體垂體移植至腎包膜下誘發子宮腺肌病。本實驗采用應用較廣泛的將異體垂體移植到子宮腔誘發法。其模型的發生率、程度和所需時間受小鼠品系影響［4］。國外研究表明，在SHN、C3、SLN、BALB/c、C57BLC3H×BALBPc之F1代小鼠和W istar大鼠中，SHN小鼠發病率最高，所需時間最短。Nagasawa等最早報道的子宮腺肌病模型，應用的是SHN小鼠，通過異體垂體移植手術三個月后發病率達100%，96%小鼠的腺肌病病灶突出子宮漿膜層，形成漿膜下腺肌病結節［5］。SHN系小鼠來源于瑞士白化病小鼠，在自發乳房腫瘤的同時發生腺肌病，其子宮腺肌病發生率最高［6～8］，由于目前我國仍未引進該品系，價格昂貴，購買困難，因此是國內子宮腺肌病動物研究相對滯后的原因之一［9］。BALB/c小鼠國內容易獲取，價格不貴，屬近交系，可避免移植排斥反應，國內外有使用BALB/c小鼠造模成功的報道，國內學者研究發現BALB/c小鼠經異體垂體移植后6個月，子宮腺肌病發病率高達90%，因此本實驗選用BALB/c小鼠進行研究［1］。

舒必利為多巴胺－2受體抑制劑(多巴胺通過下丘腦或直接對腺垂體催乳素分泌有抑制作用)，促進腺垂體釋放催乳素，引起高催乳素血癥，從而抑制雌激素和黃體生成素的分泌，抑制排卵，延長動情周期(延長動情間期和動情后期);子宮肌層長時間暴露PRL可導致肌層變性，利于子宮內膜的侵入;同時催乳素可促進雌激素與其受體結合，削弱子宮肌層的防御功能從而導致子宮內膜向肌層生長;催乳素亦通過刺激卵巢黃體，促進孕激素分泌，孕激素又可促進子宮內膜間質細胞的生長，誘發子宮腺肌病高發病率［10］。垂體移植誘發子宮腺肌病的發病機制與前者相似，由于小鼠子宮分泌的宮腔液含有豐富營養物質，從而使得垂體移植術后垂體能夠繼續存活，并引起高催乳素血癥，據Mori報道垂體移植術后20 d，血PRL是對照組的10倍;移植后4～6個月，小鼠子宮PRL受體的mRNA總量是正常的2～10倍［11］。目前認為催乳素在子宮腺肌病的發生發展中起觸發作用，雌激素和孕激素起進一步損傷作用［2］，這種激素失衡導致了病變的發生發展。

通過對子宮濕重、子宮濕重/終末體重、HE染色評分及發病率等方面的比較，舒必利組和垂體移植組的差別無統計學意義，雖然子宮表面未出現子宮腺肌病結節，但其顏色較對照組深，充血，局部出現膨大，HE染色證實該兩種方法誘導子宮腺肌病發病率高，由此可見BALB/c小鼠可作為較理想的模型動物。在操作可控性方面，舒必利誘導法簡單易行，死亡率低，成本低，即使是初學者造模也容易成功，但其操作過于繁瑣;垂體移植誘導法對操作者的熟練程度有一定的要求，初學者可能因操作不慎在造模過程中破壞垂體的完整性，大面積損傷子宮，術后感染，而影響模型成功率，甚至引起小鼠死亡。

本研究兩種造模方法最終都成功地誘發了小鼠子宮腺肌病，其病理組織學檢查均與人類的病理學改變相近似，因此可作為子宮腺肌病研究的模型，實驗者可根據自身條件選擇合適的模型。

(本文圖1見彩插8。)

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Com parison of Two M ouse M odels of Adenom yosis Estab lished by Sulpiride-Induction and Pituitary Transp lantation

RAO Yan－yan，XIANG Shuang－wei
(A ffiliated Union Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China)

ObjectiveThe purpose of this study was to compare the adenomyosis models in m ice generated by two different methods.M ethods Intact 7－week old，never－pregnant female BALB/c mice were random ly divided into 3 groups:control group，sulpiride group and pituitary transplantation group，15 mice in each group.M ice of the sulpiride group were given subcutaneous injections of 800 μg sulpiride per 20 g body weight daily for 5 months.A single pituitary from male mouse was transplanted into the lumen of the right uterus of mice in the pituitary transplantation group.The control group received no treatment.A ll m ice were killed after 5 months and the uteri and ovaries were weighed.The right uterus was examined under a 20－fold microscope.Results 5 months later，compared with the control group，the uterine wet weight，the ratio of wet uterus weight/body weight，morphology of HE stained uterine tissue and disease incidence were significantly increased(P＜0.05)in both two model groups.There was no statistical difference in the body weight and the ovarian wet weight(P＞0.05).ConlusionThere are no significant differences in the evaluation indexes between the sulpiride treatment and pituitary transplantation groups.Both the two methods can be used to successfully establish mouse models of adenomyosis for research of this disease.

Adenomyosis;M ice;Disease models，animal;pituitary transplantation;Sulpiride

R711.51

A

1005－4847(2010)03－0258－04

2009－10－18

饒妍妍(1982－)，女，研究方向:子宮腺肌病。E－mail:raoyanyan1998@yahoo.com.cn

項雙衛。E－mail:weijianxianggood@yahoo.com.cn