D－半乳糖致亞急性衰老大鼠尿液排泄情況觀察及其多尿機制探討

譚瑩，黃萍，操紅纓，陳秋鈴，吳清和

(1.云南省藥物研究所藥物安全性評價中心，昆明 650111; 2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

研究報告

D－半乳糖致亞急性衰老大鼠尿液排泄情況觀察及其多尿機制探討

譚瑩1，黃萍2，操紅纓2，陳秋鈴2，吳清和2

(1.云南省藥物研究所藥物安全性評價中心，昆明 650111; 2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

目的觀察D－半乳糖(D－gal)致亞急性衰老大鼠在尿液排泄方面的特點并探討其多尿癥狀機制。方法在初篩合格的SD大鼠頸背部皮下注射濃度為5%的D－gal生理鹽水溶液125 mg/(kg·d)連續8周。觀察動物在造模期間和停止造模后兩周內24 h總尿量及水負荷后排尿情況的變化;通過測定模型動物尿中K+、Na+、CL－濃度，血中ALD、ADH、ANP濃度及腎臟病理形態學觀察，探討模型動物24 h總尿量增加的機制。結果與正常對照組相比較，模型組動物24 h總尿量明顯增加;水負荷后6 h內排尿潛伏期明顯縮短，排尿次數明顯增多，但總尿量沒有明顯差異;模型動物尿中Na+、CL－濃度明顯升高，K+濃度明顯降低;血漿ALD、ADH含量顯著降低，ANP含量顯著增加，腎臟出現一系列硬化特征。結論D－gal致亞急性衰老大鼠出現的總尿量增加和排尿次數增多的情況可能與其ADH、ALD、ANP合成與分泌異常及腎臟病理形態學改變有關。

D－gal致亞急性衰老大鼠;多尿;機制

D－半乳糖(D－gal)致亞急性衰老動物模型是目前研究較為成熟，運用較為廣泛的衰老動物模型，其在外觀形態，神經內分泌系統、各主要臟器生理功能及病理形態改變等方面均與自然衰老動物具有較高的相似度。該動物的制備相對簡單易行，模型較為穩定可靠，被廣泛用于延緩衰老和防治老年癡呆藥物的篩選和作用機制探討。本研究對該種動物模型的尿液排泄情況進行初步觀察，并通過測定與尿液生成密切相關的部分神經內分泌系統指標，初步探討其多尿機制，旨在為該模型的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質量160～180 g，來源于廣東省醫學實驗動物中心［SCXK (粵)2003－0002］。動物于室內溫度(20±2)℃，濕度(50±5)%的環境中飼養，每籠5只，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，每天定量添加飼料1次，換水2次，更換墊料2次，動物自由進食、飲水，SPF級飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑

D－galactose，成都Mechem公司產品，由廣州威佳有限公司分裝，批號070918;Goat anti－rat arginine vasopressin enzyme immunoassay kit，catalogue No: QR301330103031 EIAUTL;Goat anti－rat atrial natriuretic polypeptide enzyme immunoassay kit，catalogue No:QRCT－3013321020009 EIAUTL; Goat－anti rat aldosterone enzyme immunoassay kit，以上試劑盒均為美國Ad litteram Diagnostic Laboratories，Ins產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物篩選:根據改良的Aston［1，2］法結合預實驗結果制定動物初篩標準。取大鼠80只，雌雄各半，適應代謝籠1 d，于次日禁食不禁水18 h后，灌胃給予生理鹽水作為水負荷2次，第1次3 m L/100 g，收集30 min尿液，第2次2 m L/100 g加30 min的尿量作為水負荷，收集2 h的尿量，淘汰排泄率低于25%和高于50%的動物(排泄率=尿量/給水量)。

1.3.2 動物分組:將初篩合格的動物分為正常對照組和模型對照組，雌雄各半，適應性飼養3 d后開始實驗。模型組大鼠在消毒后的頸背部皮膚，用無菌注射器注射濃度為5%的D－gal生理鹽水溶液125 mg/(kg·d);正常對照組注射等體積生理鹽水，連續8周，停止注射后繼續觀察兩周。造模期間每周稱重一次，并根據動物體重調整D－gal的注射量［3－5］。

1.4 實驗指標測定方法

1.4.1 排尿情況的觀察［6，7］:①24 h總尿量:從造模開始，每周測定動物24 h總尿量一次。具體方法:動物禁食不禁水18 h，次日將動物置于代謝籠中，禁食，自由飲水，收集24 h尿液(放入和拿出前輕壓大鼠下腹部排盡余尿，每4 h收集尿液1次避免揮發)。②水負荷后6 h內排尿情況:從造模開始，每兩周測定動物水負荷后6 h內的排尿情況1次。具體方法:據大鼠體重灌胃給予生理鹽水1 m L/100 g，立即收集30 min尿液，再次給予各組生理鹽水4 m L/100 g加上30 min的尿量(用生理鹽水代替)。將動物置于自制的特殊鼠籠中，觀察并記錄動物排尿潛伏期，6h內排尿次數及總量。

1.4.2 尿中Na+、K+、CL－濃度:將24 h總尿量測定實驗中收集的尿液取2 m L分裝于試管中，用全自動尿液分析儀測定Na+、K+、CL－濃度。

1.4.3 血漿ALD、ADH、ANP含量:于實驗結束當天，大鼠眼眶后靜脈叢取血1.5 m L，分別用肝素及EDTA－Na2、抑肽酶抗凝，室溫下3500 r/min，離心15 m in，吸取上層血漿，用ELISA法測定血漿中ALD、ADH、ANP濃度，具體操作步驟按照試劑盒說明書要求。

2 實驗結果

2.1 24 h總尿量的變化

與正常對照組相比較，模型組動物24 h總尿量自造模后第4周至第10周明顯增加，兩者差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)。結果見圖1。

(注:與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖1 24 h總尿量動態變化Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.1 The total volume of urine during 24 h at different times

2.2 水負荷后6 h排尿的變化

與正常對照組相比較，造模4周后，模型組動物水負荷后6 h內的排尿潛伏期明顯縮短，排尿次數明顯增加，兩者差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01);但水負荷后6 h內的總尿量，兩組相比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。結果見圖2、3。

(注:與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖2水負荷后6 h內排尿潛伏期的變化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.2 The incubation period of urination within 6 h after water load

(注:與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖3水負荷后6 h內排尿次數的變化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.3 The frequency of urination within 6 h after water load

2.3 尿液中Na+、K+、CL-濃度的變化

與正常對照組相比較，模型組大鼠尿液中K+濃度明顯降低，Na+、CL－濃度明顯升高，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。結果見表1。

表1 尿中Na+、K+、CL－濃度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

表1 尿中Na+、K+、CL－濃度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

注:與正常對照組比較，*P＜0.05。Note:Compared with the control group，*P＜0.05.

組別(Group)K+Na+CL－正常組(Control)110.32±30.98 30.54±7.56 40.22±9.54模型組(Model)77.54±10.77*70.22±18.02*90.43±16.77*

2.4 血漿ALD、ADH、ANP濃度的變化

從表2可以看出:與正常對照組相比較，模型組大鼠血漿ANP含量明顯升高，ALD、ADH含量明顯降低，兩者差異均具有非常顯著性意義(P＜0.01)。結果見表2。

表2 血漿ALD、ADH、ANP濃度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

表2 血漿ALD、ADH、ANP濃度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

注:與正常對照組比較，**P＜0.01。Note:Compared with the control group，**P＜0.01.

組別(Group)ALD ADH ANP正常組(Control)112.11±20.11 10.34±2.13 123.11±22.11模型組(Model)76.06±10.3**6.42±1.06**227.35±30.54**

2.5 腎臟組織病理學觀察

2.5.1 HE染色:與正常對照組比較，模型組大鼠腎單位的數量明顯減少，部分腎單位代償性肥大，腎間質內結締組織增生不明顯;腎小球數目減少，球內毛細血管內皮細胞及腎小球囊壁層上皮細胞重度增生，系膜容積增大;腎小管萎縮，腎小管和集合管內皮細胞大量增生，部分肥大腎小管細胞融合，腎小管上皮細胞腫脹，管腔縮小，甚至已無小管管腔結構，部分近曲小管發生玻璃樣變性。

2.5.2 PAS染色:與正常對照組比較，模型組大鼠腎小球囊壁層內皮細胞明顯增生，系膜增生，毛細管袢受壓，入球血管萎縮、硬化，基底膜增厚;腎小管萎縮，上皮細胞脂肪變性，管腔擴張，小管內皮細胞增生，基膜增厚。結果見圖4(彩插3)。

3 討論

D－gal致亞急性衰老動物模型是由我國學者首先提出的，經過世界范圍內的長期研究和探索，該模型及其衰老學說得到了不斷深入和發展，但該類模型在尿液生成與排泄方面的報道少見。基于此，本課題對該種動物模型的尿液排泄情況進行了觀察，初步得出了D－gal致亞急性衰老動物模型會出現“多尿”癥狀，包括尿量增多(多尿)和排尿次數增加(尿頻)。關于該種動物模型總尿量增多的機制，本課題由以下兩方面進行初步探討:

3.1 與尿液生成密切相關的神經內分泌系統

目前許多學者認為抗利尿激素、心鈉素、醛固酮三者共同作用，是參與維持機體內環境最重要的因素，而這些激素的分泌與神經內分泌系統密切相關。

抗利尿激素(ADH)的主要作用是提高遠曲小管和集合管對水的通透性，增加髓袢升支粗段對NaCL的主動重吸收和內髓部集合管對尿素的通透性，使髓質組織間液溶質增加，滲透濃度提高，利于尿濃縮，是尿液濃縮和稀釋的關鍵性調節激素［6，7］。醛固酮(ALD)有潴鈉排鉀作用，可促進腎臟遠曲小管及集合管重吸收鈉、水和排鉀，在調節水、電解質代謝方面扮演著重要的角色［8］。心鈉素(ANP)具有強大的利鈉、利尿作用，并具有快、短、強的特點，其作用從以下幾個方面發揮:①心鈉素可通過增加腎小球濾過率、增加腎髓質的血流量及抑制近曲小管和集合管對鈉的重吸收，產生利尿利鈉作用;②心鈉素能抑制腎近球旁細胞釋放腎素，并通過對腎素－血管緊張系統的抑制以及對腎上腺皮質的直接作用，抑制醛固酮的分泌，它不僅抑制醛固酮的基礎分泌率，亦能抑制由ACTH、血管緊張素、鉀等刺激的醛固酮分泌;③心鈉素亦能抑制抗利尿激素的合成、釋放及作用。據此，測定ADH、ALD、ANP對于分析亞急性衰老動物所出現的多尿癥狀具有重要意義。

實驗結果顯示，①D－gal致亞急性衰老動物血漿ADH含量明顯降低，ADH分泌減少使腎小管對水液的重吸收功能下降，尿液濃縮過程障礙，導致尿液排泄增加。②模型動物24 h尿液中Na+、CL－排出量增加，K+排出量減少，這與參與腎臟水液代謝調節的重要潴鈉激素ALD保Na+排K+的作用恰恰相反，初步考慮該種動物模型ALD的合成與釋放受阻，使水的重吸收減少，尿量也隨之增加。經測定亞急性衰老動物血漿ALD含量降低，提示該種模型ALD合成與分泌障礙可能是其24 h總尿量增加的原因之一。③衰老動物血漿ANP含量明顯增加，說明該種動物腎小球濾過率、腎髓質的血流量增加，近曲小管和集合管對鈉的重吸收減少，使得尿液的排出量增加。同時，ANP的增加可以抑制了ADH、ALD的分泌和釋放，阻礙尿液的濃縮過程，從而進一步促使模型動物尿量增多。另外，ALD、ADH的分泌受到下丘腦－垂體－腎上腺皮質(HPA)軸的調控，我們在實驗中觀察到模型動物下丘腦、垂體、腎上腺萎縮，這可能是造成模型動物上述激素分泌異常的原因之一，即模型動物身體機體全面衰退，神經內分泌系統功能老化是其多尿的機制之一。

3.2 動物腎臟形態、功能的改變

尿的生成包括腎小球的濾過、腎小管和集合管的重吸收和分泌三個基本過程。腎臟是出現衰老比較明顯的臟器之一，衰老腎臟的主要病理改變是腎小球硬化及小管間質纖維化，這些改變使得腎臟的生理功能受到很大影響，也是老年出現多種泌尿系統疾病的原因之一［9］。因此，在研究D－gal致亞急性衰老動物“多尿”機制的過程中，腎臟形態和功能的研究是一個重要的方面。有文獻報道D－gal對腎臟的損害作用，主要通過產生大量的晚期糖基化終末產物(AGEs)和氧化應激損傷［8］。過多的AGEs在腎小球系膜和毛細血管部位沉積，使腎小球體積增大，腎小球系膜膨大，基底膜增厚，腎小球硬化［8］，這與本研究的結果基本一致。由于腎臟與尿液生成、排泄的關系較為復雜，該模型動物腎臟形態學改變與其“多尿”的關系還有待進一步探討。

(本文圖4見彩插3。)

［1］Aston RA.Rat diuretic screening procedure［J］.Toxicol Applied Pharmacol，1959，1(3):277－282.

［2］王蕾，姚東云，馬紅梅.中藥利尿藥理實驗動物篩選方法探討［J］.中國比較醫學雜志，2006，16(11):694－695.

［3］Song X，Bao M，Li D，et al.Advanced glycation in D－galactose induced mouse aging model［J］.Mech Aging Dev，1999，108 (3):239.

［4］Zhang Q，Huang YG，Li XK，et al.GM1 ganglioside prevented the decline of hippocampal neurogenesis associated with D－galactose［J］.Neuropharmacol Neurotoxicol，2005，16(12): 1297.

［5］朱亞珍，朱虹光.D－半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法［J］.復旦學報(醫學版)，2007，34(4):617－619.

［6］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.第1版.北京:人民衛生出版社，1985，788.

［7］原文鵬，張碩峰，沈欣，等.尿頻康對大、小鼠排尿的抑制作用及藥動學實驗［J］.中國實驗方劑學雜志，2000，6(6):18.

［8］李冰，鄭浩.D－半乳糖誘導大鼠腎臟損害的糖基化機制及藥物干預作用［J］.中國實驗動物學報，2008，16(6):435－440.

Polyuria and Its M echanism in D-Galactose-Induced Aging Rats

TAN Ying1，HUANG Ping2，CAO Hong－yin2，CHEN Qiu－ling2，WU Qing－he2
(1.Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;
2.Traditional Chinese Medicine University of Guangzhou，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo observe the changes of urination of D－galactose－induced aging rat models and explore its mechanism.M ethods The senescent mouse model was established by subcutaneous injection of D－gal(5%，125 mg/kg·d) for 8 weeks.To measure the total volume of urine during 24 h and the frequency of urination within 6 h after water load during the injection period and convalescent period and detect the contents of ALD，ADH，ANP in blood and K+，Na+，CL－in urine，and examine the renal pathomorphology.Results Compared with the control group，the total volume of urine during 24 h was increased，incubation period shortened and the frequency of urination increased within 6 h after water load(P＜0.05，P＜0.01).The concentration of Na+，CL－，ANP was increased and the ADH，ALD，K+decreased(P＜0.05，P＜0.01).At the same time，some renal histological changes were observed in the aging models.ConlusionThe D－galactoseinduced aging rat models have characteristics of polyuria.The mechanism of their polyuria is related with decreased ADH and ALD synthesis and secretion，increased ANP increase，and sclerotic alterations of the kidneys.

D－gal mimetic aging rats;Urination;Polyuria;Mechanism

R－33

A

1005－4847(2010)04－0296－04

2009－12－21

國家自然科學基金(編號:30873425)。

譚瑩(1979－)，女，博士，云南省藥物研究所藥物安全性評價中心。

吳清和，男，教授，博士生導師，E－mail:zyylb@gzhtcm.edu.cn