被動吸煙下調大鼠卵巢雌、孕激素及其受體的表達

尹崇高，李若葆，李洪利，楊曉

(1.山東省濰坊醫學院護理學院，濰坊 261053;2.濰坊醫學院人體解剖學教研室，濰坊 261053; 3.濰坊醫學院醫學研究實驗中心，濰坊 261053)

研究報告

被動吸煙下調大鼠卵巢雌、孕激素及其受體的表達

尹崇高1，李若葆2，李洪利3，楊曉1

(1.山東省濰坊醫學院護理學院，濰坊 261053;2.濰坊醫學院人體解剖學教研室，濰坊 261053; 3.濰坊醫學院醫學研究實驗中心，濰坊 261053)

目的利用W istar大鼠煙霧吸入模型，觀察被動吸煙對W istar大鼠卵巢結構的影響，檢測生殖激素水平，分析生殖內分泌的變化，為提倡生育期婦女避免被動吸煙提供新的理論依據。方法建立大鼠煙霧吸入模型。32只健康雌性W istar大鼠，鼠齡(60±5)d，每只體重200～250 g，隨機分為空白對照組和實驗組，每組16只。實驗組吸煙3個月，對照組正常飼養。3個月后處死兩組大鼠。酶聯免疫吸附試驗方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測雌鼠血清中雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progesterone，P4)的水平;常規石蠟切片，免疫組織化學SP法檢測各組雌鼠卵巢雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)的表達情況。所得數據采用SPSS軟件作統計學處理分析，比較各組間差異程度。結果①酶聯免疫吸附試驗結果:吸煙3個月大鼠血清E2水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有顯著性;吸煙3個月大鼠血清P4水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有顯著性。②免疫組織化學結果:ER主要表達在大鼠卵巢組織的各級生長卵泡的顆粒細胞的細胞核內，呈棕黃色顆粒狀分布，卵泡膜細胞和間質細胞也有少量表達。吸煙3個月的大鼠卵巢組織中ER的表達顯著低于空白對照組。PR主要表達在大鼠卵巢組織卵泡的顆粒細胞的細胞質和細胞核中，呈棕黃色顆粒狀分布，吸煙3個月的大鼠卵巢組織中PR的表達顯著低于空白對照組。結論①成功的建立了大鼠被動吸煙模型。②被動吸煙可使大鼠血清中E2及P4水平明顯降低，使大鼠卵巢中ER及PR的表達減少，提示被動吸煙可破壞卵巢的功能，引起生殖內分泌失調。

被動吸煙;卵巢;雌激素;孕激素;雌激素受體;孕激素受體

近年來，被動吸煙對非吸煙婦女生殖健康的危害，引起越來越多的國內外學者重視。他們認為環境煙草煙氣中有很多有害物質如苯、鉛、錳、多環芳烴等可對女性生殖系統產生損害作用。這些損害表現為:①循環雌激素、孕激素減少。②對卵泡發育的影響。Bordel等［1］研究發現，尼古丁能通過誘導細胞的凋亡而抑制卵泡的發育。尼古丁、鎘和多環芳烴類物質可使卵泡成熟率降低，成熟的卵母細胞數目減少，造成婦女生殖能力下降，卵子儲備量下降［2］。卵泡刺激素升高是卵子儲備量低下的表現。Cooper等［3］對290名婦女檢測發現，吸煙婦女的卵泡刺激素比被動吸煙婦女高39%，較不吸煙者高60%。透明帶圍繞在卵母細胞周圍，在卵母細胞受精前后、胚胎孵化及種植過程中起著重要的作用。受精后胚胎的透明帶變硬，然后逐漸變薄，透明帶變薄易于胚胎孵出。以往的研究僅限于流行病學分析和體外實驗對女性的生殖系統的影響，但模擬年輕女性被動吸煙，研究被動吸煙對卵巢內分泌功能的影響尚無報道。

本實驗通過建立大鼠被動吸煙模型，酶聯免疫法檢測血清雌激素、孕激素的水平，免疫組織化學技術檢測雌激素受體、孕激素受體在卵巢組織中的表達，并與未吸煙對照組進行比較，探討被動吸煙對卵巢生殖內分泌功能的影響，為提倡生育期婦女避免被動吸煙提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物采用健康、性成熟、未交配過的雌性SPF級W istar大鼠，鼠齡(60±5)d，體質量200～250 g，來源于山東大學實驗動物中心［SCXK(魯) 2003－0004］，實驗期間提供足量的自來水及山東大學動物實驗中心提供的普通飼料，動物室溫度保持在22℃左右，自動通風，光照周期8:00－18:00，適應3 d后用于實驗。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 實驗主要試劑

大鼠E2、P4ELISA檢測試劑盒購自美國ADL公司;兔抗大鼠ER、PR多克隆抗體購自Santa－Cruz公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的制備與分組:健康性成熟未交配過的雌性SPF級W istar大鼠32只，鼠齡(60±5)d，體質量200～250 g，隨機分為2組，即吸煙組和正常對照組，每組16只，正常對照組在正常呼吸空氣條件下飼養，吸煙組給予煙霧吸入。將每組大鼠分籠喂養，給基礎飼料，注意給充足的水。參照徐凌等［4］大鼠煙霧吸入模型，利用有機玻璃、鋼架、小型風扇等自制大鼠被動吸煙煙箱，規格:91cm×59 cm×62 cm。每天將煙霧吸入組大鼠置于煙箱內，每次燃燒10支芙蓉香煙(湖南中煙工業公司生產，84 mm過濾嘴香煙，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)，每支燃燒約12 min，停5～6 min，共約3 h，每天2次，每周5d，連續3個月。3個月后在動情前期處死吸煙動物和相應的對照動物，取卵巢組織標本進行免疫組織化學染色，取血清進行ELISA。

1.3.2 ELISA:完全按大鼠E2、P4ELISA試劑盒操作步驟進行。最后在450 nm波長處測定各孔的A值，利用標準曲線得出相應的濃度值。

1.3.3 免疫組化:完全按照SP免疫組化試劑盒操作說明進行。結果分析:采用醫學圖像分析軟件進行分析。將每張切片待測細胞在顯微鏡下定位后，在圖像監視器上顯示圖像，測定該區域細胞的積分光密度(integral optical density，I A)、面積(area)的值，再隨機觀察10個視野(×200)，分別取每張切片的平均值作為該組的所測激素受體的含量值，最后以整個一組的均值作為該受體在卵巢組織表達的相對強度。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 ELISA檢測血清中激素水平

2.1.1 大鼠血清E2水平:吸煙組大鼠血清E2水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)，提示被動吸煙對大鼠血清中E2水平有影響。

2.1.2 大鼠血清P4水平:吸煙組大鼠血清P4水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)，提示被動吸煙對大鼠血清中P4水平有影響。

表1 吸煙組與對照組大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

表1 吸煙組與對照組大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

組別(Group) E2 P4 A值(A value)濃度(ng/m L)Concentration A值(A value)濃度(nmol/L)Concentration空白對照組(Control)1.76±1.06 35.74±30.30 1.45±0.44 68.96±26.30吸煙組(Smoking)0.95±1.10 21.02±18.65 0.92±0.69 39.98±21.36

2.2 免疫組織化學檢測卵巢ER及PR蛋白表達

ER主要表達在大鼠卵巢組織的各級生長卵泡的顆粒細胞的細胞核內，呈棕黃色顆粒狀分布，卵泡膜細胞和間質細胞也有少量表達(見圖1、2)。吸煙三個月的大鼠卵巢組織中ER的表達顯著低于空白對照組(P＜0.01，見表2);PR主要表達在大鼠卵巢組織卵泡的顆粒細胞的細胞質和細胞核中(見圖3、4)，呈棕黃色顆粒狀分布，吸煙三個月的大鼠卵巢組織中PR的表達顯著低于空白對照組(P＜0.01，見表2)。(圖1～4見彩插6。)

表2 吸煙組與對照組大鼠卵巢ER、PR的表達情況(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

表2 吸煙組與對照組大鼠卵巢ER、PR的表達情況(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

組別(Group)ER PR面積(Area)積分光密度(I A)面積(Area)積分光密度(I A)空白對照組(Control)214.85±30.47 337346.74±4694.30 516.28±316.98 90992.50±50062.66吸煙組(Smoking)165.92±33.25 29164.62±6038.65 173.04±92.1530085.75±13156.50

3 討論

世界衛生組織(World Health Organization，WHO)定義被動吸煙為不吸煙者，在一周中有一天以上吸入吸煙者呼出的煙霧超過15min/d。近年來，被動吸煙對非吸煙婦女生殖健康的危害，引起越來越多的國內外學者重視。他們認為環境煙草煙氣中有很多有害物質如苯、鉛、錳、多環芳烴等可對女性生殖系統產生損害作用。

卵巢能夠合成大量的甾體激素，主要是雌激素和孕激素。在哺乳動物，E2、P4是主要由女性/雌性性腺卵巢直接分泌的性激素，因此卵巢的功能狀態對于女性/雌性生殖組織的生長、分化以及生育功能和月經周期/動情周期的維持具有十分重要的作用。雌激素對卵巢本身的發育是必需的，卵巢生發上皮的功能以及在皮質各期卵泡的成長和發育均需要雌激素的存在，顆粒細胞和卵泡膜細胞既是分泌產生雌激素的部位，其本身也有ER，并接受雌激素的影響。排卵前卵泡液中含有一定濃度的P4，研究者推測，卵泡成熟的信號轉導可能需要特殊的卵泡內孕酮環境，通過特異性地與細胞核受體結合而產生作用［5］。

在成年人和哺乳動物中，E2調節卵巢功能。ER受體2種亞型均表達在卵巢中。ERβ在顆粒細胞間質及生發上皮的核內呈陽性表達，ERα在間質生發上皮的核內呈陽性表達，在顆粒細胞中呈陰性反應。表明在卵巢生理功能調節中ERβ發揮更主要作用［6］。如果ER在卵泡內不足，卵泡的發育、生長、成熟、激素產生和排卵一系列生理活動將會受限。它們不僅影響女性性征的發育、妊娠及行為，也在卵巢內部產生重要影響［7］。Chen等［8］對新近結婚欲妊娠的371名不吸煙的健康婦女進行了前瞻性調查，分析344個未孕周期和329個懷孕周期兩者晨尿中雌酮結合物(estrone conjugates，E1C;雌激素的主要代謝產物)孕二醇－3－葡糖苷酸(pregnanediol－3－glucuronide，PdG;孕激素的主要代謝產物)的水平。Flouris等［9］研究發現暴露于二手煙的婦女，17β－雌二醇和孕激素水平明顯降低，LH和FSH水平降低。為了評估ETS對卵巢功能的直接影響，Vidal等［10］將原代培養的黃體顆粒細胞暴露于ETS。ETS低濃度和高濃度都使雌激素的產生明顯降低。在一個相似的模擬系統，新煙堿和尼古丁競爭性抑制芳香化酶，而芳香化酶是雄激素轉化為雌激素的必需酶。此外，高濃度ETS可以引起孕激素生成降低。游離尼古丁和尼古丁酒石酸氫鹽可以降低人類黃體顆粒細胞分泌孕激素。

本實驗用ELISA檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠血清中雌激素水平的改變，結果顯示被動吸煙組大鼠血清雌激素均比空白對照組明顯降低;用免疫組化方法檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠卵巢中ER的表達，結果顯示被動吸煙組大鼠ER的表達顯著低于空白對照組，提示被動吸煙可引起血清中E2含量的減少，也可引起卵巢ER的表達減少。

Gava等［11］用免疫組化檢測小鼠卵巢孕激素受體各亞型的表達，對于排卵卵泡的卵泡膜和顆粒細胞，竇前卵泡，竇狀卵泡和黃體的卵泡膜細胞上都表達PRA、PRB，而竇前卵泡、竇狀卵泡和黃體的顆粒細胞上僅表達PRB。王育華等［12］研究表明，卵巢中大量表達PRA、PRB。對PR蛋白敲除(PRKO)研究表明，PRKO小鼠不能排卵，但小鼠的卵泡是成熟卵泡，并有成熟的卵母細胞和完整的功能，能在體外受精，且排卵前的顆粒細胞能分化成黃體并能表達黃體的標記物P450側鏈裂解酶［13］。因此PR是黃體生成激素(LH)依賴排卵所必需，而非顆粒細胞化成黃體所必備。ADAMTS－l是孕激素誘導排卵的關鍵調節劑，用超排卵劑量的GnRH刺激PRAKO、PRBKO、PRKO的小鼠，與野生型的小鼠比，PRAKO小鼠的超排卵嚴重受損，但被孕激素誘導的ADAMTS－1和組織蛋白酶L(cathepsin－L)并未受損;PRBKO小鼠的促超排卵無影響;PRKO小鼠的促超排卵和孕激素誘導的成熟卵泡的壁層顆粒細胞上的ADAMTS－l和cathepsin－L被完全抑制［14］。這說明PRA的表達是排卵所必需的，PRB可能調節卵泡破裂的信號傳導通路，但這種機制尚未完全闡明。PRA/PRB與LH對排卵前的卵泡顆粒細胞的ADAMTS－l基因的反式激活起到協同作用，成為該基因誘導性的輔助調節子。對豬的卵丘－卵復合物(COCs)的研究表明，用FSH和LH作用于COCs，8h后卵丘上的PRB達高峰，20 h后PRA達高峰，PRA、PRB時空變化可影響卵丘細胞的增大和卵母細胞重新啟動第二次減數分裂［15］。張鴻波等［16］研究發現PR不僅受P4的調節，而且受E2的調節。

本實驗用ELISA檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠血清中孕激素水平的改變，結果顯示被動吸煙組大鼠血清孕激素均比空白對照組明顯降低;用免疫組化方法檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠卵巢中PR的表達，結果顯示被動吸煙組大鼠PR的表達顯著低于空白對照組，提示被動吸煙可引起血清中P4含量的減少，也可引起卵巢PR的表達減少。

(本文圖1～4見彩插6。)

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Effects of Passive Sm oking on Rat Ovarian Estrogen and Progesterone and Their Recep tors

YIN Chong－gao1，LI Ruo－bao2，LI Hong－li3，YANG Xiao1
(1.School of Nursing，2.Department of Anatomy，3.Medical Experiment Center，Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

ObjectiveThe aim of this study was to observe the effects of passive smoking on ovarian structure in Wistar rats and detect reproductive hormone levels to analyze the changes in reproductive endocrinology，and provide further theoretical and experimental evidence for promoting reproductive age women to avoid passive smoking.M ethods Thirty two healthy female W istar rats，200－250 g weight，were random ly divided into control and smoking groups(n=16).The control rats fed normally and the experimental rats smoked for 3 months.All rats were killed at 3 months after the experiment.The serum E2and P4levels were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The expressions of ER and PR were assessed by immunohistochemistry.The data were analyzed with SPSS 11.5 for W indows.Results①The ELISA showed that the serum levels of both estrogen and progesterone were significantly lower in the smoking rats than those in non－smoking rats(both P＜0.05).②Immunohistochemical results showed that ER positive material was mainly distributed in the cell nuclei of the rat ovarian granulosa cells.The ER expression level was significantly lower in theovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).PR positive material mainly was distributed in the cytoplasm and cell nucleus of the rat ovarian granulosa cells.The level of PR expression was significantly lower in the ovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).Conlusion①A rat model of passive smoking has been successfully established.②Passive smoking can decrease the serum levels of E2and P4in rats and the expression of ER and PR in rat ovaries.Passive smoking can harm ovarian function and cause reproductive endocrine disorders.

Passive smoking;Ovary;Estrogen;Progesterone;ER;PR;Rats

Q954.62

A

1005－4847(2010)04－0331－05

2009－11－29

山東省衛生廳資助項目(編號:2007HZ021)

尹崇高(1979－)，男，講師，主要從事臨床外科。

李若葆，濰坊醫學院解剖學教研室，副教授，碩士生導師，E－mail:lirb@w fmc.edu.cn