切除腎上腺對大鼠自身免疫性腦脊髓炎敏感性的影響

壽旗揚，陳方明，賈臨超，方明筍，周衛民，陳民利

(1.浙江大學動物科學學院，杭州 310029;2.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

研究報告

切除腎上腺對大鼠自身免疫性腦脊髓炎敏感性的影響

壽旗揚1、2，陳方明2，賈臨超2，方明筍2，周衛民2，陳民利2

(1.浙江大學動物科學學院，杭州 310029;2.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的研究腎上腺切除導致下丘腦－垂體－腎上腺(HPA)軸功能缺陷對W istar大鼠誘發的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的敏感性的影響。方法W istar大鼠單、雙側腎上腺切除后，用GPSCH－CFA誘導各組大鼠產生EAE，并觀察臨床評分、MBP抗體、皮質醇、Th1細胞因子和腦組織Bcl－2/Bax蛋白表達的變化，并與Lewis大鼠的EAE模型進行比較。結果GPSCH－CFA誘導后，雙側切除腎上腺的W istar大鼠平均神經癥狀評分最高為4.60分，發病率為100%，血清中皮質醇水平明顯降低和MBP抗體水平明顯升高，IFN－γ、TNF－α和IL－2水平均明顯升高，大腦皮層和下丘腦中Bcl－2蛋白表達均明顯降低和Bax蛋白表達均明顯升高。結論雙側腎上腺切除導致HPA功能缺陷能顯著增加W istar大鼠誘發EAE的敏感性。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎;W istar大鼠;腎上腺切除;皮質醇;Th1細胞因子

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是由T淋巴細胞介導的，以中樞神經系統(CNS)血管周圍單核細胞浸潤和白質脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病［1，2］，由于Lewis、DA大鼠和PL/J小鼠的價格昂貴、不易獲得或無來源等因素，致使國內的研究者以各種途徑尋求價格低、易獲得、而對EAE誘發并非敏感的W istar大鼠研究EAE模型的制作，但其成功率和敏感性較低［3，4］。而Lewis大鼠體內存在下丘腦－垂體－腎上腺軸功能(HPA)缺陷，血漿中皮質類固醇水平較低，這是Lewis大鼠易感EAE的主要原因［5］，實驗通過切除W istar大鼠腎上腺損傷HPA功能，使其體內皮質類固醇下降，以Lewis大鼠作對照，對W istar大鼠在切除腎上腺后GPSCH誘發的EAE癥狀、體征等進行評價，研究腎上腺切除導致HPA缺陷對W istar大鼠誘發的EAE的敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性W istar大鼠60只，體質量為240～260 g，中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK(滬)2007－0005］;SPF級雄性Lewis大鼠15只，體質量為180～200 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK(京)2007－0001］，無菌手術在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障動物實驗設施進行［SYXK(浙)2008－0115］。普通級雄性DHP白色豚鼠8只，體質量為300～340 g，湖州城區西風洋特種經濟動物養殖場［SCXK(浙)2008－0037］。以上實驗動物使用按3R原則給予人道的關懷。

1.2 試劑

不完全弗氏佐劑(WDY20080421，Biobasic Inc.)，卡介苗(0809，Biobasic Inc.)，大鼠皮質醇(Cortisol)ELISA試劑盒(R＆D，E0900042)，髓鞘堿性蛋白抗體(MBP－Ab)ELISA試劑盒(R＆D，E0900043)，γ－干擾素(IFN－γ)ELISA試劑盒(R＆D，0902281)，α－腫瘤壞死因子(TNF－α)ELISA試劑盒(R＆D，0903031)，白介素－2(IL－2)ELISA試劑盒(R＆D，0902251);一抗:兔抗Bcl－2、Bax(Santa Cruz進口分裝，H2208、H2446);二抗:鼠兩步法試劑盒(中杉金橋，8557);DAB顯色試劑盒(中杉金橋，457500A)。

1.3 儀器設備

Varioskan Flash多功能酶標儀(美國Thermo); 725型－86℃低溫冰箱(美國Forma);AG204－電子分析天平(瑞士Mettler);HM 335E型輪轉切片(德國Microm);染色機(德國Leica);AP280組織包埋機(德國Microm);脫水機(德國Microm);Axiovert 200熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss)。

1.4 W istar大鼠腎上腺切除

取220～240 g W istar大鼠45只，預飼養7 d后，腹腔注射3.0%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)，剃去腹部被毛，在中線肋角處橫向切口，切除雙側或單側腎上腺各15只大鼠，其余15只大鼠行假手術。術后以5%生理鹽水(含1%葡萄糖)代飲水，恢復7 d后實驗。

1.5 GPSCH-CFA的配制

用3%戊巴比妥鈉麻醉豚鼠，放血后迅速取出脊髓，用生理鹽水制成50%的豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)，與等量的含1mg/m L卡介苗的完全弗氏佐劑(CFA)混合，用注射器抽打至GPSCH－CFA油包水乳劑。

1.6 GPSCH-CFA誘導EAE實驗

將0.4 m L GPSCH－CFA注入單、雙側腎上腺切除的大鼠和Lewis大鼠雙后腳掌進行免疫。設單側腎上腺切除組、雙側腎上腺切除組、假手術組、Lewis大鼠組，每組15只。另取15只正常W istar大鼠做正常組，實驗期間隔天記錄體重和進行神經功能評分。免疫23 d后，大鼠EAE癥狀進行評價和病理學觀察和細胞因子的測定。

1.7 神經功能評分

大鼠EAE神經功能評分，評分標準:無任何臨床癥狀為0分，尾部張力消失為1分，后肢無力為2分，后肢癱瘓為3分，后肢癱瘓伴前肢無力為4分，全身癱瘓或瀕臨死亡為5分。

1.8 皮質類固醇、M BP抗體和Th1細胞因子測定

免疫23 d后，各組大鼠取血，3000 r/m in離心10 min，分離血清，參照ELISA試劑盒說明書，用競爭法測定血清中MBP抗體和皮質醇，用雙抗體夾心法測定血清中IFN－γ、TNF－α和IL－2。

1.9 免疫組織化學法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達

大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉，從心臟灌注4%多聚甲醛進行在體固定，取腦組織，保存于4%多聚甲醛48 h后，取材、脫水、包埋，行4 μm切片，切片經脫臘至水，3m L/L H2O2室溫孵育10 min，高壓修復5 m in，一抗1∶100稀釋，4℃過夜，二抗37℃孵育30 m in，DAB室溫顯色3～10 m in(顯微鏡下控制顯色程度)。各步驟間用0.01 mol/LPBS(pH 7.2)充分洗滌3 m in×3次。蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。對照實驗用PBS代替一抗。應用圖像分析系統Image－Pro－Plus5.0進行大腦皮層和下丘腦Bcl－2和Bax的陽性細胞面積分析，在10×40倍光學顯微鏡下各個組織隨機選取6個不重復的視野，計算陽性細胞的面積，并取均值進行統計分析。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 一般觀察和體重變化

Lewis大鼠在免疫后9～10d出現臨床癥狀和體重明顯下降，雙側切除腎上腺的W istar大鼠在免疫后12～15 d出現臨床癥狀和體重明顯下降，表現為尾部無力、拖垂、活動明顯減少，后肢無力、麻痹，伴有大小便失禁，嚴重者四肢麻痹，癱瘓，其中雙側切除腎上腺的W istar大鼠死亡1只。單側切除腎上腺的Wistar大鼠和假手術的W istar大鼠在免疫后12～15d出現輕微臨床癥狀和體重略有下降，但免疫后21d體重有所恢復。各組體重變化見圖1。

圖1 各組大鼠平均體重變化Fig.1 Changes of the mean weight of rats in each group

2.2 神經癥狀評分和發病率

Lewis大鼠在免疫后9～10 d均出現臨床神經癥狀，平均神經癥狀評分最高為3.10分，發病率為100%;雙側切除腎上腺的W istar大鼠在免疫后12～15 d均出現臨床神經癥狀，平均神經癥狀評分最高為4.60分，發病率為100%;單側切除腎上腺的W istar大鼠和假手術的W istar大鼠在免疫后12～15 d部分出現臨床神經癥狀，平均神經癥狀評分最高分別為1.19分和0.83分，發病率分別為73.33%和 58.33%。各組神經癥狀評分變化見圖2。

圖2 各組大鼠平均神經癥狀評分變化Fig.2 Change of the mean clinical scores of rats in each group

2.3 皮質醇和M BP抗體水平的變化

與正常組比較，Lewis大鼠和單、雙側切除腎上腺W istar大鼠血清中皮質醇水平明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);與假手術和單側切除腎上腺大鼠比較，Lewis大鼠和雙側切除大鼠血清中皮質醇水平明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。與正常組比較，假手術與單、雙側切除腎上腺W istar大鼠和Lewis大鼠免疫后血清中MBP抗體水平明顯升高(P＜0.01);與假手術組大鼠比較，雙側切除腎上腺W istar大鼠和Lewis大鼠血清中MBP抗體水平明顯升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的血清中皮質醇和MBP抗體水平的變化(±s)Tab.1 Changes in the levels of serum cortisol and MBPAb in rats of each group(±s)

表1 各組大鼠的血清中皮質醇和MBP抗體水平的變化(±s)Tab.1 Changes in the levels of serum cortisol and MBPAb in rats of each group(±s)

注:與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01;與假手術組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01;與單側切除組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01.Note:Compared with the control group，aP＜0.05，aaP＜0.01; Compared with the sham－operation group，bP＜0.05，bbP＜0.01; Compared with the unilateral adrenalectomy group，cP＜0.05，ccP＜0.01.

組別Group皮質醇(ng/m L) Cortisol MBP抗體(ng/m L) MBP－Ab正常組Control group 360.5±29.6 9.94±3.77假手術組Sham－operation group 336.6±37.1 15.99±2.37aa單側切除組Unilateral adrenalectomy group 315.6±36.9a16.34±3.20aa雙側切除組Bilateral adrenalectomy group 193.5±49.7aabbcc18.81±2.23aabLewis大鼠組Lewis rat group 233.1±69.7aabbc20.12±3.48aab

2.4 Th1細胞因子水平的變化

與正常組比較，Lewis大鼠和單、雙側切除腎上腺Wistar大鼠血清中IFN－γ、TNF－α、IL－2水平均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與假手術組比較，Lewis大鼠和雙側切除大鼠血清中IFN－γ水平明顯升高(P＜0.05)，Lewis大鼠血清中TNF－α水平明顯升高(P＜0.05);Lewis大鼠和雙側切除腎上腺的Wistar大鼠血清中IFN－γ、TNF－α、IL－2水平均高于單側切除腎上腺W istar大鼠，但差異無顯著性(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的血清中γ－干擾素、α－腫瘤壞死因子和白介素－2水平的變化(±s)Tab.2 Changes in the levels of serum IFN－γ，TNF－α and IL－2 in rats of each group(±s)

表2 各組大鼠的血清中γ－干擾素、α－腫瘤壞死因子和白介素－2水平的變化(±s)Tab.2 Changes in the levels of serum IFN－γ，TNF－α and IL－2 in rats of each group(±s)

注:與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01;與假手術組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01;與單側切除組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01.Note:Compared with the control group，aP＜0.05，aaP＜0.01;Compared with the sham－operation group，bP＜0.05，bbP＜0.01;Compared with the unilateral adrenalectomy group，cP＜0.05，ccP＜0.01.

組別Group γ－干擾素(ng/mL) IFN－γ α－腫瘤壞死因子(ng/mL) TNF－α白介素－2(ng/mL) IL－2正常組Control group 30.39±6.16 15.44±3.66 43.14±12.33假手術組Sham－operation group 38.86±11.22 21.52±3.70a59.56±11.17a單側切除組Unilateral adrenalectomy group 51.45±15.98a25.77±7.78a68.43±16.98a雙側切除組Bilateral adrenalectomy group 65.64±24.66aab26.38±7.69aa74.72±18.71aaLewis大鼠組Lewis rat group 67.46±23.02aab27.71±3.65aab72.74±7.71aa

2.5 大腦皮層和下丘腦Bcl-2/Bax蛋白表達的變化

與正常組比較，Lewis大鼠和單、雙側切除腎上腺Wistar大鼠大腦皮層和下丘腦中Bcl－2蛋白表達均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);雙側切除腎上腺的Wistar大鼠大腦皮層和下丘腦中Bcl－2蛋白表達明顯低于假手術組大鼠(P＜0.05，P＜0.01)，且低于單側切除腎上腺的大鼠，但差異無顯著性(P＞0.05)。Lewis大鼠和雙側切除腎上腺W istar大鼠大腦皮層和下丘腦中Bax蛋白表達均明顯高于正常組、假手術組和單側切除腎上腺組的大鼠(P＜0.05，P＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠的大腦皮層和下丘腦Bcl－2/Bax蛋白表達的變化(±s，μm2)Tab.3 Changes of the expression of Bcl－2/Bax in the cerebral cortex and hypothalamus in rats of each group(±s，μm2)

表3 各組大鼠的大腦皮層和下丘腦Bcl－2/Bax蛋白表達的變化(±s，μm2)Tab.3 Changes of the expression of Bcl－2/Bax in the cerebral cortex and hypothalamus in rats of each group(±s，μm2)

注:與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01;與假手術組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01;與單側切除組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01.Note:Compared with the control group，aP＜0.05，aaP＜0.01;Compared with the sham－operation group，bP＜0.05，bbP＜0.01;Compared with the unilateral adrenalectomy group，cP＜0.05，ccP＜0.01.

組別Group大腦皮層(Cerebral cortex)下丘腦(Hypothalamus) Bcl－2 Bax Bcl－2 Bax正常組Control group 5356.4±1986.9 344.9±129.7 6310.9±1532.6 304.4±106.1假手術組Sham－operation group 3142.4±728.5a358.1±90.4 4560.4±1206.7a380.7±111.7單側切除組Unilateral adrenalectomy group 2665.9±590.2a404.7±142.6 2702.3±284.6aab423.9±156.2雙側切除組Bilateral adrenalectomy group 1847.2±504.7aab632.4±135.2abc2357.6±287.7aabb811.5±162.3aabbccLewis大鼠組Lewis rat group 1700.0±672.1aabbc657.4±101.3aabbc2507.2±537.1aabb1095.1±317.8aabbcc

3 討論

研究報道，Lewis大鼠體內存在HPA缺陷，血漿中檢測到的皮質類固醇水平很低，這可能是Lewis大鼠易感EAE的主要原因之一。因為機體在正常應激時，HPA是免疫調節的負反饋環路，HPA功能低下時機體易患自身免疫性疾病;皮質類固醇能抑制Th1細胞的產生，Th1分泌IL－2、TNF－γ和TNF－α，這些細胞因子刺激B淋巴細胞產生大量的自身抗體，從而引發EAE疾病;皮質類固醇還可誘導TGF－β生成，而大量研究證明TGF－β、IL－10可以預防EAE的復發［6］。

本實驗通過切除W istar大鼠的腎上腺來損傷HPA功能，使其體內皮質類固醇下降，Th1細胞因子增多，免疫應答提高。實驗中發現Wistar大鼠切除腎上腺后，大鼠血清皮質醇水平顯著降低，但切除兩側腎上腺的大鼠血清皮質醇水平降低至正常W istar大鼠的50%，略低于正常Lewis大鼠的皮質醇水平。各組大鼠通過GPSCH－CFA誘導后，雙側、單側切除腎上腺的W istar大鼠和假手術的W istar大鼠在平均神經癥狀評分最高分別為4.60、1.19和0.83分，發病率分別為100%、73.33%和58.33%。W istar大鼠兩側腎上腺切除后，臨床評分高于Lewis大鼠的評分，說明兩側腎上腺切除的W istar大鼠對誘發EAE的敏感性增加。

輔助性T細胞亞群(Th)及其細胞因子在MS和EAE的發病機制及治療中有重要的作用。根據細胞因子分泌模式，CD4+T細胞可分為Thl和Th2亞群，Thl主要分泌IL－2，TNF－γ和TNF－α，稱為Th1型細胞因子;Th1介導細胞免疫、細胞毒性T細胞(CTL)和巨噬細胞活化以及遲發型超敏反應(DTH)［7－9］。實驗中發現單、雙側切除腎上腺W istar大鼠血清中IFN－γ、TNF－α、IL－2水平均高于假手術組的大鼠，且Lewis大鼠和雙側切除腎上腺的Wistar大鼠血清中IFN－γ、TNF－α、IL－2水平均高于單側切除腎上腺W istar大鼠。

細胞凋亡是普遍存在于組織細胞內的細胞死亡的形式之一，是不同于壞死的正常生理性的程序性細胞死亡，Bcl－2家族蛋白在調節細胞凋亡過程中起重要作用，Bcl－2是抑制細胞凋亡的基因，而Bax作為Bcl－2的同源體其作用是抑制Bcl－2發揮作用，Bax的過度表達能誘導細胞凋亡［10］。雙側切除腎上腺的W istar大鼠大腦中Bcl－2蛋白表達明顯低于假手術大鼠和單側切除腎上腺的大鼠。雙側切除腎上腺W istar大鼠大腦皮層和下丘腦中Bax蛋白表達均明顯高于正常組、假手術組和單側切除腎上腺組的大鼠，且與Lewis大鼠的Bcl－2/Bax蛋白表達相當。

腎上腺切除導致HPA功能缺陷能顯著增加Wistar大鼠誘發的EAE的敏感性。為EAE模型的建立提供了一種新的制作方法，并為人類多發性硬化癥的預防治療研究和藥物篩選與評價研究提供理論基礎。

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In fluence of Excision of Adrenal G land on the Sensitivity to Experim ental Autoimm une Encephalom yelitis in Rats

SHOU Qi－yang1、2，CHEN Fang－ming2，JIA Lin－chao2，FANG M ing－sun2，ZHOU Wei－m in2，CHEN Min－li2
(1.Zhejiang University College of Animal Sciences，Hangzhou 310029，China; 2.Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053)

ObjectiveTo study the effect of dysfunction of the hypothalamus－pituitary－adrenal(HPA)axis induced by excision of adrenal gland on the sensitivity to experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)in rats.MethodsThe EAE was induced by GPSCH－CFA after the removal of adrenal gland in W istar rats.The clinical scores，MBP antibody and cortisol were tested and the change of Th1 cytokines and Bcl－2/Bax expression in brain was assayed. The results were compared with that in Lewis rat EAE models.ResultsThe highest nervous symptom score of W istar rats after adrenalectomy was 4.6 and incidence rate was 100%.The serum cortisol level decreased and MBP antibody level increased significantly(P＜0.05，P＜0.01)，the level of IFN－γ，TNF－α and IL－2 increased significantly(P＜0.05，P＜0.01)，and the Bcl－2 expression was significantly decreased and Bax expression was significantly increased in the cerebral cortex and hypothalamus(P＜0.05，P＜0.01).ConlusionExcision of adrenal gland causes dysfunction of hypothalamus－pituitary－adrenal axis and increases the sensitivity to experimental autoimmune encephalomyelitis in W istar rats.

W istar Rats，Adrenalectomy，Cortisol，Th1 Cytokines;Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE

2010－01－18

浙江省醫藥衛生科學研究基金(2007B152);“浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目”資助。

壽旗揚(1979－)，男，研究方向:動物實驗和比較醫學，E－mail:sqy133@126.com

陳民利(1963－)，女，教授，研究方向:比較醫學，E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn

R593.2

A

1005－4847(2010)04－0350－05