姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞抑制作用的研究

藍育青 鄭海生 張弛 周懷勝 郭慧

青光眼已成為世界范圍內占第二位的不可逆性致盲眼病，而濾過手術是治療青光眼的重要手段之一，其方法是通過被切除的小梁組織形成一濾過通道，使房水外流從而達到降低眼壓，保存殘存視功能的目的。但濾過手術存在10%～30%的失敗率［1］，其失敗的直接原因主要是濾過口處成纖維細胞的增殖、遷移而導致濾過道的纖維瘢痕化，使濾過通道堵塞.這也是青光眼臨床與研究中所面臨的難題之一，術中應用抗增殖藥物如絲裂霉素(mitomycin，MMC)經術后的臨床觀察可提供手術的成功率，但也存在一定的毒副作用限制其使用。因此許多眼科工作者為防治濾過手術的失敗而尋找安全、有效抑制成纖維細胞增殖的方法進行著不懈的努力。姜黃素是一種歷史悠久的傳統中藥，具有多種療效:抗纖維增殖作用［2］、抑制血管生成［3］、抗腫瘤作用［4］、抗氧化作用［5］、抗炎作用等多種藥理作用，且無明顯毒副作用具有較好的臨床應用前景。目前其在對其他器官和組織的成纖維細胞方面的研究和應用中取得了一定的成果和進展，但在研究姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞中的作用還比較少，為研究姜黃素對體外培養的人眼Tenon囊成纖維細胞的抗增殖的作用效果，從而探索防治青光眼手術區濾過泡纖維瘢痕化的新途徑，提高青光眼手術成功率。筆者設計以下實驗。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器設備

1.1.1 試劑 CCK-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司)、姜黃素(購自SIGMA公司)、vimentin單克隆抗體(博士德公司)、DAB顯色試劑(博士德公司)。

1.1.2 主要儀器設備 CO2培養箱(德國Heraeus BB16)、手術顯微鏡(德國 Zeiss)、光學倒置顯微鏡(德國 Leica MPS-30)、Wellscan MK3酶標儀(美國 Labsystem Dragon)、

1.2 方法

1.2.1 人眼Tenon囊成纖維細胞的培養、鑒定 眼球結膜下Tenon囊組織標本為中山大學附屬第二醫院眼科青光眼手術切除組織，采用組織塊培養法原代接，第3～6代細胞用于實驗。按常規方法培養細胞［6］，并活體顯微鏡、組織學觀察與進行細胞照相。利用蓋玻片培養法進行HE染色，并取第3代細胞按免疫細胞化學試劑盒說明書作Vimentin染色鑒定細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞的增殖的影響 實驗方法、步驟:①取處于對數生長期的Tenon囊成纖維細胞以10%胎牛血清的高糖DMEM制備為2500個/ml細胞懸液，每孔加入100 μl的細胞懸液分別接種于4塊96孔培養板中培養24 h，貼壁;②至細胞長至單層后，分別在細胞中加入終濃度為 10、20、40、80 μg/ml的姜黃素，同時設不加藥的陰性對照和只加培養液的空白對照，每組設4個復孔;③再將96孔培養板分別培養24、48、72、96 h后，向每孔中加入10%胎牛血清的高糖 DMEM培養基100 μl及10 μlCCK-8繼續放入培養箱內培養3 h;④酶標儀檢測450 nm處各孔OD值;每組實驗重復3次。

1.2.3 細胞增生抑制率的計算 根據CCK-8的吸光度(A)值計算出細胞增生抑制率并繪制時間、劑量效應曲線。增生抑制率%=(對照組 A值-實驗組 A值)/對照組 A值×100%

1.2.4 統計學方法 所有數據用SPSS 11.0軟件包處理，實驗結果數據計量資料用(±s)表示，CCK-8對人眼Tenon囊成纖維細胞抑制率的濃度和時間關系采用多組定量資料的單因素方差分析進行統計分析。

2 結果

2.1 人眼Tenon囊成纖維細胞的體外培養及生物特性鑒定

2.1.1 體外培養人眼Tenon囊成纖維細胞的形態特征和生物特性 倒置相差顯微鏡下觀察細胞，可見原代培養的組織塊約一周后細胞開始從組織塊周邊游離出來(圖1A)，胞體狹長，透亮，胞漿豐富，核圓形、橢圓形。胞膜清晰，呈典型的梭形，繁殖較快，約2～3周細胞增殖基本融合，細胞變長，靠近，呈放射狀或漩渦狀走行(圖1B)。

圖1 人眼Tenon囊成纖維細胞原代與傳代培養A.原代培養的組織塊約6～7 d后細胞開始從組織塊周邊游離出來B.成纖維細胞胞膜清晰，呈典型的梭形，呈放射狀或漩渦狀走行

2.1.2 人眼Tenon囊成纖維細胞組織學觀察HE染色及免疫細胞化學鑒定 細胞經HE染色，可見細胞呈兩頭尖的長梭型，不規則。胞核較大，色淺藍，位于細胞中央;細胞胞漿豐富，色淡紅，細胞膜清晰(圖2A)。細胞經免疫化學Vimentin染色，可見陽性產物呈棕色，均勻分布于細胞的胞漿中(圖2B)。根據組織的取材部位、細胞的形態并結合免疫細胞化學的鑒定可確定實驗中所培養的細胞為人眼Tenon囊成纖維細胞。

圖2 人眼Tenon囊成纖維細胞HE染色與鑒定A HE染色，呈長梭型，胞核較大，色淺藍，位于細胞中央;胞漿豐富，色淡紅 B經Vimentin染色，陽性產物呈棕色，均勻分布于細胞的胞漿中

2.2 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞增殖的影響 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞增殖的影響結果見表1，并根據不同濃度姜黃素組在不同時間里對細胞的抑制率繪制時間、劑量效應曲線(圖3)。

圖3 不同濃度姜黃素組在不同時間里對人眼Tenon囊成纖維細胞的抑制率變化

表1 姜黃素對Tenon囊成纖維細胞增生的影響(±s)

表1 姜黃素對Tenon囊成纖維細胞增生的影響(±s)

注:單因素方差分析表明各實驗組與對照組相比，﹡P＜0.01;與臨近濃度組比較，△P＜0.01;與臨近時間組比較，★P＜0.05

姜黃素濃度(μg/m l)值 生長抑制率0 0.552±0.010 0.660±0.008 1.188±0.032 1.535 24 h 48 h 72 h 96 h OD值 生長抑制率 OD值 生長抑制率 OD值 生長抑制率 OD 97.7±0.023 10 0.498±0.008﹡ 9.8 0.533±0.014﹡★ 19.2 0.602±0.020﹡★ 49.3 0.660±0.009﹡★ 57.0 20 0.430±0.004﹡△ 22.1 0.436±0.016﹡△★ 33.9 0.499±0.011﹡△★ 58.0 0.569±0.012﹡△★ 62.9 40 0.389±0.005﹡△ 29.5 0.385±0.007﹡△★ 41.7 0.212±0.005﹡△★ 82.2 0.078±0.003﹡△★ 94.9 80 0.319±0.011﹡△ 42.2 0.321±0.013﹡△★ 51.4 0.093±0.004﹡△★ 92.2 0.036±0.006﹡△★

即姜黃素濃度≥10 μg/ml時，能抑制人眼Tenon囊成纖維細胞的增殖(P＜0.01)，并隨藥物濃度的升高、時間的延長，姜黃素對Tenon囊成纖維細胞的抑制強度逐漸加大(P＜0.01)。72 h以上姜黃素對細胞的生長抑制率基本穩定。

3 討論

青光眼是僅次于白內障的導致視力喪失的主要原因。據流行病學研究資料表明，全球原發性青光眼的患者約超過6680萬人，其中約10%失明，因此對青光眼的防治是防盲治盲公共衛生工作的重點之一，具有重大的意義。目前，濾過手術是青光眼治療的重要手段之一，但有些患者術后卻因濾過道的纖維瘢痕化，使濾過通道堵塞而導致手術的失敗。通常濾過通道的瘢痕形成中一個主要的原因是:手術創傷刺激手術部位的Tennon囊下間隙使成纖維細胞增殖、移行、釋放膠原蛋白，引起纖維血管反應和傷口的收縮，纖維瘢痕形成，導致濾過失敗［7］。因此本課題為了探索防治青光眼手術區濾過泡纖維瘢痕化的新途徑，提高青光眼手術成功率，設計了此實驗。本實驗直接從人眼Tenon囊組織中培養出成纖維細胞，其生物學特性符合人眼病變的情況。筆者通過姜黃素作用體外培養的人眼Tenon囊成纖維細胞發現:在0～80 μg/m l濃度作用24～96 h范圍內，姜黃素可以抑制人眼Tenon囊成纖維細胞的增長，且呈劑量和時間依賴性。姜黃是一種姜科姜黃屬的草本植物，具有多種療效。Elena等［8］研究發現，姜黃素能夠通過抑制蛋白激酶Cε(PKCε)的表達誘導體外培養的硬皮病肺成纖維細胞(scleroderma lung fibroblasts，SLF)發生凋亡。同樣高蔚等［9］在研究姜黃素對大鼠肺成纖維細胞(MLF)增殖和凋亡的影響中發現姜黃索對MLF有抑制作用，存在劑量依賴與時間依賴性。本實驗所得結果基本上與上述研究發現一致，這說明姜黃素對不同組織中成纖維細胞增殖都有抑制作用。但姜黃素抑制人眼Tenon囊成纖維細胞的分子機制仍不清楚。目前，國內外在對姜黃素抑制各種腫瘤細胞或類腫瘤細胞作用機制研究中發現可能與對細胞信號傳導及各種細胞生長因子的影響有關［10］。如可能與下調NF-kappaB，抑制 iNOS、COX-2 活性有關［11］。而姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞增殖的抑制是否同樣存在相似的機制，這也是下一步需要研究的問題。

在本實驗中所用的Cell Counting Kit-8(CCK-8)法評價姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細胞的增殖影響是用于測定細胞增殖或毒性試驗中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。其利用了四唑鹽-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中;不需要預配各種成分(比較MTT法減少了加DMSO的步驟，從而可進一步減少實驗中因操作引起的誤差)。WST-8被細胞內脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養基中，生成的甲臜量與活細胞數量成正比。與其他研究體外培養細胞中研究細胞增殖的實驗方法相比，CCK-8法檢測細胞增殖實驗的靈敏度比其他四唑鹽如MTT、XTT、MTS或WST-1高、誤差小，并且CCK-8溶液相當穩定，對細胞沒有毒性，因此可以長時間孵育。因此，CCK-8比色檢測法在檢測細胞增殖中正成為一種主流方法。

在本實驗初步證實了了姜黃素對體外培養的人眼Tenon囊成纖維細胞具有抗增殖作用，為下一步進行動物實驗提供了研究基礎，同時對姜黃素防治青光眼手術區濾過泡纖維瘢痕化，提高青光眼手術成功率提供了理論依據。

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