長期吸煙對肺癌組織TGF-β1、VEGF-C表達的影響及臨床意義

劉 濤，李若葆

肺癌，又稱原發性支氣管肺癌，腫瘤細胞起源于支氣管黏膜或腺體，是常見的惡性腫瘤之一。肺癌的病因復雜，目前越來越多的研究者從基因水平研究吸煙與肺癌的關系，對肺癌的早期診斷、治療及改善預后具有重要意義，其中TGF-β1、VEGF-C是研究的熱點。

轉化生長因子 β1（TGF-β1），是 Tuker等于 1984年發現的一種與多種上皮性腫瘤生長有關的多肽性負性細胞生長調控因子。近年研究發現TGF-β1在肺癌的發生發展及預后起著非常重要的作用。肺癌的生長與轉移依賴腫瘤相關血管、淋巴管提供營養和轉移通道。血管內皮生長因子C（VEGF-C）是迄今為止唯一能特異地作用于血管、淋巴管內皮細胞刺激因子A，通過與血管、淋巴管內皮細胞上的高親和力的酪氨酸受體 VEGFR-2（KDR）和VEGFR-3（flt-4）結合，誘導血管及淋巴管增生，從而促進腫瘤的生長和轉移。近年來國內外學者對TGF-β1、VEGF-C在肺癌組織中的表達及臨床意義的研究很多，而吸煙對肺癌組織中TGF-β1、VEGFC表達的影響及臨床意義的研究較少。本試驗采用免疫組織化學研究長期吸煙和非長期吸煙肺癌患者癌組織、癌旁組織及周邊“正常”組織結構差異及TGF-β1和VEGF-C表達的差異，探討長期吸煙對肺癌組織及周邊組織TGF-β1、VEGF-C表達的影響及臨床意義。旨為臨床上吸煙者肺癌的早期診斷提供理論依據，將對肺癌的早期診斷、指導治療以及預后產生積極的作用。

表 1 TGFβ1、VEGF-C在肺癌組織以及周邊組織中表達情況

1 資料和方法

1.1 研究對象 取濰坊市第二人民醫院病理科2006-01～2007-12行手術治療并經病理確診為肺癌的蠟塊，其中吸煙組98份，非吸煙組30份。所有病例臨床資料完整，吸煙史明確，按WHO(1984)關于吸煙調查方法標準建議：每天吸煙1支以上，時間長于1年者為吸煙。吸煙量1～9支/d為輕度，10～19支/d為中度，20支以上為重度，部分病歷中每日吸煙量（支）的記錄，僅有吸煙年限，吸煙年限雖不能精確地計算出吸入量，但吸煙時間的長短亦在一定程度上反映出其吸煙量及受煙霧刺激的多少，故將其吸煙年限<10年者定為輕度，11～19年為中度，20年以上為重度。本研究中所指的長期吸煙是指吸煙年限在20年以上、吸煙支數在20支/d以上。所有患者術前均未接受化療、放療或其它針對腫瘤的治療。吸煙組男78份，女20份；非吸煙組男21份，女9份；年齡35～74歲，中位數年齡為57歲。依據1981年WHO《肺腫瘤組織學分型》制定的標準分類：吸煙組鱗癌43份，腺癌38份，鱗腺癌9份，小細胞癌8份；非吸煙組鱗癌11份，腺癌9份，鱗腺癌5份，小細胞癌5份。按2002年國際抗癌聯盟（UICC）修訂的標準進行TNM分期：吸煙組I期、Ⅱ期52份，Ⅲ期、Ⅳ期46份；非吸煙組I期、Ⅱ期11份，Ⅲ期、Ⅳ期19份。分化程度：吸煙組高分化程度18份，中等分化63份，低分化程度17份；非吸煙組高分化7份，中等分化12份，低分化11份。吸煙組有淋巴結轉移者51份，無轉移47份，遠處轉移31份，無遠處轉移67份；非吸煙組有淋巴結轉移18份，無轉移12份，遠處轉移13份，無遠處轉移17份。所取組織塊用10%中性甲醛固定，常規脫水透明，浸蠟包埋、切片，分別進行 TGF-β1、VEGF-C 和蘇木素-伊紅染色（HE染色）。

1.2 試劑 PV-9000二步法免疫組化染色試劑盒、兔抗人TGF-β1多克隆抗體、兔抗人血管內皮生長因子C單克隆抗體、濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 選取術后經病理確診為肺癌蠟塊，進行連續5 μm切片，防脫片處理后進行免疫組織化學染色，PV-9000二步法步驟按試劑盒提供的說明書進行。

1.4 免疫組化結果分析 TGFβ1、VEGF-C陽性染色均為棕黃色顆粒，定位于細胞漿。TGFβ1、VEGFC陽性細胞計數：每份標本隨機選取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，共計1000個細胞，計算陽性細胞百分率。細胞陽性細胞數<10%為表達陰性（-）；陽性細胞數10%～20%為表達陽性（+）；陽性細胞數>20%為表達陽性 （++）；陽性細胞數>50%為表達強陽性（+++）。

1.5 統計學處理 使用SPSS 11.5統計學軟件包進行數據處理分析，定性資料與各臨床指標之間的關系行χ2檢驗，以及Speannan等級相關等方法。

2 結果

2.1 TGF-β1、VEGF-C組間陽性表達的比較 TGF-β1、VEGF-C均表達于細胞漿，陽性呈棕黃色顆粒狀（圖1～4）。在吸煙組以及非吸煙組肺癌組織中TGF-β1和VEGF-C均呈現高表達，但兩組間無顯著性差異，又都明顯高于癌旁組織及周邊組織（P<0.05）；吸煙組癌旁組織TGF-β1與VEGF-C的陽性表達與非吸煙組癌旁組織TGF-β1與VEGF的陽性表達存在統計學差異 （P<0.05）；吸煙組周邊組織TGF-β1、VEGF-C表達高于非吸煙組“正常”組織（P<0.05）；吸煙組癌旁組織TGF-β1和VEGF-C表達明顯高于周邊 “正常”組織 （P<0.05）；非吸煙組癌旁組織TGF-β1表達明顯高于周邊“正常”組織（P<0.05），見表1。

2.2 TGF-β1蛋白與VEGF-C在肺癌組織的表達的相關關系 TGF-β1蛋白、VEGF-C在兩組肺癌組織中的陽性表達率均明顯增加，并且與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移密切相關。TGF-β1、VEGF-C過度表達可能與肺癌的發生、發展及惡性潛能有關（P<0.05，表 2、3）。

2.3 吸煙組與非吸煙組兩種因子表達的相關性

無論吸煙組還是非吸煙組肺癌組織中VEGF-C、TGF-β1蛋白表達均密切相關（表4），VEGF-C 與TGF-β1蛋白在兩組肺癌組織中的表達呈正相關，提示TGF-β1可能上調VEGF-C的表達。兩者在肺癌的發生發展及轉移中可能具有協同作用。

圖 1 吸煙組肺癌組織免疫組化（×200），TGFβ1 陽性表達于細胞漿

圖 2 吸煙組肺癌旁組織免疫組化（×200），TGFβ1 弱陽性表達于細胞漿

圖 3 非吸煙組肺癌組織免疫組化 （×200），VEGF-C 陽性 表達，在細胞漿呈棕黃色彌漫顆粒

圖 4 非吸煙組肺癌癌旁組織免疫組化（×200），VEGF-C 弱陽性表達于胞漿

表 2 吸煙組肺癌組織TGFβ1、VEGF-C表達水平與肺癌病理生理特征關系

表 4 兩組肺癌組織中TGFβ1與VEGF-C表達的相互關系

3 討論

吸煙嚴重危害著人類的健康，現在的流行病學和科學實驗已相繼證明，吸煙是肺癌的主要病因。吸煙除了導致肺組織形態學改變以外，還可導致基因的改變。TGF-β與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關。在多種腫瘤中可觀察到TGF-β的高度表達，在腫瘤生長的早期，TGF-β通過抑制細胞生長周期從G1期→S期抑制正常細胞生長和腫瘤細胞發生。但隨著腫瘤的進展，TGF-β在腫瘤細胞中高表達，表明腫瘤細胞對TGF-β生長抑制作用的反應喪失或減弱。不僅抑制了機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和殺傷，并同時通過促進腫瘤對微血管的生長及調節基質，促進了腫瘤的浸潤和轉移。越來越多的研究發現肺癌組織中常有TGF-β的增高。Asselin-Paturel等[1]從新鮮腫瘤活檢標本中提取mRNA進行反轉錄PCR處理,發現所有的NSCLC細胞中均有TGF-β1mRNA的高表達。

表 3 非吸煙組肺癌TGFβ1、VEGF-C表達水平與肺癌病理生理特征關系

VEGF-C基因是1996年由Joukov等[2]首次從人前列腺癌細胞株PC-3的cDNA文庫中克隆并分離得到，又稱血管內皮生長因子相關蛋白（VRP），是一種特異性的血管、淋巴管內皮細胞調節因子，與血管內皮細胞生長因子受體-3（VEGFR-3）結合后，能誘導血管及淋巴管內皮細胞生長，在腫瘤組織中表達增加促進腫瘤轉移。據Santos等[3]研究顯示肺功能正常的吸煙者和中度慢性阻塞性肺病（COPD）患者肺動脈中VEGF表達均增高,且在平滑肌細胞中表達的程度與血管壁增厚程度相關。Arinago等[4]對180例NSCLC患者手術標本的免疫組化研究結果顯示：VEGF-C和VEGFR-3的陽性表達率分別為 76．1%和 22．2%；其中腺癌組織中VEGF-C的表達明顯高于其它病理類型；VEGF-C或（和）VEGFR-3陽性表達是影響患者生存期的重要因素，特別是VEGF-C和VEGFR-3同時陽性患者的預后最差；多因素分析結果顯示，受體VEGFR-3陽性表達是影響NSCLC患者預后的獨立因素。Kojima等[5]對129例TNM分期的T1期肺腺癌患者的研究結果提示腫瘤細胞中VEGF-C與內皮細胞上VEGFR-3的聯合表達，是影響T1期肺腺癌患者預后的獨立因素。本研究也顯示，吸煙組癌旁組織、周邊“正常”組織 TGF-β1、VEGF-C 陽性表達均顯著高于非吸煙組癌旁組織、周邊“正常”組織 TGF-β、VEGF-C 的表達（P<0.05）；吸煙組和非吸煙組癌旁組織TGF-β1表達明顯高于周邊“正常”組織（P<0.05）。吸煙組VEGF-C表達在癌旁組織明顯高于周邊“正常”組織（P<0.05），而在非吸煙組VEGF-C陽性表達在癌旁組織與“正常”組織無顯著性差別（P＞0.05）。提示吸煙導致肺組織早期損傷。

VEGF-C一方面可以通過一系列復雜的機制誘導血管的形成，從而促使腫瘤體積增大，并使腫瘤邊緣部分的瘤細胞與淋巴管的接觸增多，或通過靜脈-淋巴管吻合處，使血液進入淋巴管；另一方面，它還能增加微血管的通透性，并能誘導新生淋巴導管的形成，從而促使腫瘤細胞的淋巴管轉移[6]。研究顯示，VEGF-C和TGF-β1的表達呈正相關，表明TGF-β1刺激腫瘤血管生成的作用是通過旁分泌途徑誘導VEGF-C的表達，間接地刺激腫瘤血管的生成，同時VEGF-C對TGF-β1亦有類似作用，兩者通過促血管的生成而共同促進腫瘤的進展和轉移[7]。由此可以推測，TGF-β1通過上調VEGF-C表達，間接促進腫瘤血管生成可能是促進腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移的機制之一[8，9]。本研究結果也顯示，在TGF-β1蛋白表達陽性的吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達陽性率為89.2%，在TGF-β1蛋白表達陽性的非吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達陽性率為80%。而在TGF-β1蛋白表達陰性的吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達率僅為43.3%，在TGF-β1蛋白表達陰性的非吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達陽性率僅為30.8%，表明TGF-β1蛋白與VEGF-C表達呈顯著正相關，即TGF-β1與VEGF-C具有協同作用。

[1]Asselin-Paturel C,Echchakir H,Carayol G,et al.Quantitative analysis of Th1,Th2 and TGF-beta 1 cytokine expression in tumor,TIL and PBL of non-small cell lung cancer patients.Int J Cancer,1998,77(1)∶7-12.

[2]Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al．A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C,is a ligand for the Flt-4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases[J]．EMBO(Eur Mol Biol Organ)J,1996,15(2)：290-298．

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[4]Arinago M,Noguchi T,Takeno S,et a1．Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with non-smaIl cell lung carcinoma[J]．Cancer,2003,97(2):457-464．

[5]Kojima H,Shijubo N,Yamada G,et a1．Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with T1 lung adenocarcinoma[J]．Cancer,2005,104(8):1668-1677.

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