日本大耳白黑眼兔在不同生長階段蛋白質營養與肝臟相關基因表達的關系

呂建敏，劉月環

(1.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053;

2.浙江省醫學科學院浙江省實驗動物動物中心，杭州 310013)

研究報告

日本大耳白黑眼兔在不同生長階段蛋白質營養與肝臟相關基因表達的關系

呂建敏1，劉月環2

(1.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053;

2.浙江省醫學科學院浙江省實驗動物動物中心，杭州 310013)

目的研究日糧粗蛋白水平和生長階段對日本大耳白黑眼兔(WHBE兔)肝臟相關基因表達的影響。方法采用兩因素實驗設計，分別選取斷奶和2月齡WHBE兔各20只進行為期1個月的幼兔期和育成兔期飼養實驗，每個階段實驗均將兔隨機分為5組，各組日糧粗蛋白水平分別為12%、14%、16%、18%和20%，實驗結束，用實時熒光定量PCR技術測定肝臟胰島素樣生長因子－1(IGF-1)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶－C(PEPCK-C)的mRNA的表達豐度。結果生長階段和粗蛋白水平均對WHBE兔肝臟IGF-1mRNA的表達豐度有顯著影響，育成兔期IGF-1 mRNA的表達豐度明顯高于幼兔期;日糧粗蛋白水平為16%和18%時IGF-1mRNA表達豐度較高，顯著高于其他3組。PEPCK-C mRNA的表達也以16%粗蛋白組最高，幼兔期和育成兔期之間差異無顯著性。結論日糧粗蛋白水平對IGF-1和PEPCK-C基因表達有顯著影響，生長階段與IGF-1mRNA表達密切相關。

日糧;粗蛋白;生長階段;WHBE兔;基因表達

圖2 IGF-I、PEPCK-C和GADPH cDNA real-time PCR 產物的熔解曲線Fig.2Melting curve analysis of IGF-I, PEPCK-C and GADPH real-time PCR amPlified Products

生物技術的飛速發展為營養學的深入研究提供了有力的保障，利用現代生物技術，可以使人們從分子水平去認識某些營養物質的作用機制，不僅能更準確地判斷動物對某些營養物質的精確需要量，而且能深刻揭示它們的作用機理。近年來對營養與基因相互關系的研究已逐漸為人們所重視，主要體現在營養水平對調控代謝的相關酶和激素的基因表達影響研究。日本大耳白黑眼兔(WHBE兔)是浙江中醫藥大學動物實驗研究中心培育的實驗兔新品系，研究WHBE兔營養需要和相關功能基因表達關系，對于制定相應飼養標準，合理配制日糧，完善WHBE兔的系統研究具有積極作用。本文從蛋白質營養入手，選取了與蛋白質代謝相關的兩種基因肝臟胰島素樣生長因子－1(IGF-I)mRNA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶－C(PEPCK-C)mRNA，利用熒光定量PCR技術，研究不同日糧粗蛋白水平對WHBE兔肝臟IGF-I mRNA和PEPCK mRNA表達豐度的影響，以期從分子水平上得到不同生長階段的WHBE兔對日糧粗蛋白的精確需要量，同時為蛋白質需要研究方法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

斷奶和2月齡雄性WHBE兔各20只，體質量分別為800～1000 g和2000～2200 g，來源于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心【SCXK(浙)2005－0022】，用于幼兔和和育成兔的飼養實驗。每階段兔均飼養30 d，實驗在浙江中藥大學動物實驗研究中心進行【SYXK(浙)2003－0004】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

將幼兔和育成兔均隨機分為5組，每組4只，分別飼喂含12%、14%、16%、18%和20%粗蛋白的日糧，各組飼料配方和營養水平見表1和表2。

實驗結束，處死動物，迅速采集肝臟樣本，液氮冷凍，待實驗室分析用。

1.2 肝臟IGF-I和PEPCK-C基因表達分析

1.2.1 肝細胞總RNA的提取

(1)將肝臟組織在液氮中磨成粉末后，再以50～100 mg組織加入1 m L Trizol液研磨，樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

(2)研磨液室溫放置5 min，然后以每1 m L Trizol液加入0.2 m L的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s。

(3)取上層水相于一新的離心管，按每m L Trizol液加0.5 m L異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000 g離心10 min。

表1 日糧配方(風干基礎)Tab.1 Composition of the experimental diets(air dry basis)

表2 日糧營養水平(風干基礎)Tab.2 Nutrient levels of the experimental diets(air－dry basis)

(4)棄去上清液，按每m L Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500 g離心5 m in。

(5)小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10 min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于無酶水中。

(6)使用核酸測定儀測定RNA的濃度，并根據A260/280值判斷RNA的質量，實驗所用樣本都在1.8～2.0之間。

1.2.2 肝細胞總RNA的反轉錄:按Takara反轉錄酶試劑盒說明書進行反轉錄。

1.2.3 引物設計與合成:IGF-I和PEPCK-C的引物根據NCBI上登錄的兔IGF-I序列(OCU75390)和PEPCK-C片段序列(EF616471)設計合成。內參GADPH的引物根據NCBI登錄的兔GADPH序列(NM:001082253)設計合成。所有引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。見表3。

表3 IGF-I，PEPCK-C及GADPH的PCR引物序列表Tab.3 The PCR primers for IGF-I，PEPCK-C and GADPH

1.2.4 cDNA的熒光定量PCR:以SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 μL反應體系，包括SYBR Green I熒光染料預混試劑10 μL、ROXⅡ0.4 μL、上游和下游引物(20 μmol/L)各0.25 μL、cDNA模板1 μL和雙蒸去離子水8.1 μL。反應條件:①94℃預變性15 s;②94℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s并采集熒光信號，共40個循環;③按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，60℃升至94℃，60℃保溫1 min、94℃保溫15 s，自動采集熒光。所用儀器為美國ABI公司生產的7500型real－time PCR檢測系統(Applied Biosystems)。

1.3 統計分析

將mRNA表達量最低的一組(12%粗蛋白組)作為參照(對照組)。經內標基因均一化處理后，通過2－△△CT方法計算，目標基因表達差異通過其他粗蛋白水平組樣本相對于對照組的樣本的倍數來表示。即對于除對照組以外粗蛋白水平組的樣本，相對于參照樣本的基因表達倍數為2－△△CT。

采用SAS統計軟件(1997)廣義線性模型(GLM)進行兩因素方差分析和顯著性比較，多重比較采用Duncan法。

2 結果和分析

2.1 PCR產物電泳圖及熔解曲線

由PCR產物的電泳圖(圖1)可見，目的基因(IGF-I和PEPCK-C)的片段和參比基因(GADPH)的片段大小都與設計擴增片段大小一致。Real－time PCR產物的熔解曲線見(圖2，彩插6)，IGF-1、PEPCK-C和GADPH熔解的Tm溫度分別為89.3℃，87.7℃和84.8℃，其擴增片段的特異性峰表明引物設計與反應條件均適用于此定量PCR反應。PCR擴增產物的基因序列分析結果與GenBank中兔IGF-I，PEPCK-C的相應區域的同源性在98%以上，由此可以確認擴增所得序列片段即為目的基因序列。

圖1 IGF-I、PEPCK-C和GADPH cDNA PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IGF-I，PEPCK-C and GADPH cDNA

2.2 肝臟IGF-I和PEPCK-C基因表達

幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I mRNA和PEPCK-C mRNA表達結果見表4。

由表4可知，幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I的基因表達豐度以16%和18%粗蛋白組最高，與其他3組差異有顯著性(P﹤0.05)。不同生長階段WHBE兔的肝臟IGF-Ⅰ基因表達存在顯著差異，育成兔期明顯高于生長期(P﹤0.05)。幼兔期和育成兔期WHBE兔PEPCK-C mRNA的表達隨著日糧粗蛋白水平的變化趨勢基本與IGF-I mRNA表達一致，以16%粗蛋白組最高，與12%粗蛋白組差異有顯著性(P＜0.05)，但幼兔期和育成兔期間差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論與結論

胰島素樣生長因子(IGF-I)是下丘腦－垂體－靶器官生長軸的終端，是生長激素啟動生長活性的主要介導者，不僅反映動物的營養和生長狀況，而且對免疫系統的發育和功能的維持可能具有重要意義［2］。Lemonzy等(1994)［3］發現蛋白質缺乏會導致大鼠肝、腎組織IGF-I mRNA表達下降。Kanamoto等(1994)［4］研究發現蛋白質的質量和數量均能影響大鼠肝組織IGF-I mRNA表達。Fukada等(2004)［5］和Pedroso等(2006)［6］在有關魚類的實驗中，都發現營養水平的提高可以提高IGF-I的基因表達。本實驗結果表明:在16%、18%粗蛋白水平下幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟IGF-I mRNA表達峰度均高于其他水平，且12%粗蛋白水平下表達量最小，這與前人的研究結果一致。由于肝臟中IGF-I mRNA變化會直接影響血漿中IGF-I濃含量［7］，McMurtry等(1997)［8］發現成年家禽血清中IGF-I含量要明顯高于幼年家禽，本研究也發現，育成兔期WHBE兔IGF-1的基因表達豐度顯著高于幼兔期，其原因還有待進一步研究。

表4 幼兔期和育成兔期WHBE兔IGF-1和PEPCK-C基因表達豐度Tab.4 The expression abundance of IGF-1 mRNA and PEPCK-C mRNA during growing and finishing periods

PEPCK-C是糖異生作用的關鍵酶之一，PEPCK-C的酶活性與其mRNA的表達量呈顯著相關。Lemaigre等(1994)［9］研究發現禁食或糖尿病會顯著提高PEPCK的活性。Kirchner等(2003)［10］報道，日糧蛋白水平也會影響到肝臟PEPCK mRNA的表達，蛋白質采食量過低引起虹鱒魚體內糖異生酶的基因表達水平的下降。陳偉健(2008)［11］研究發現補飼適量的菜粕，可明顯提高湖羊肝臟PEPCK-C mRNA表達峰度，而過高蛋白補飼量則使表達峰度降低。從本研究結果看，幼兔期和育成兔期WHBE兔肝臟PEPCK-C mRNA的表達量都是在16%粗蛋白水平下達到最高，在12%粗蛋白水平下最低，且差異顯著。這表明，適當的蛋白營養水平可以提高肝臟中PEPCK-C的基因表達量，但是水平過高的將失去這種作用。

綜上所述，日糧粗蛋白水平對WHBE兔肝臟的IGF-1和PEPCK-C的基因表達均有顯著影響，在16%～18%粗蛋白水平下表達豐度最大;育成兔期WHBE兔IGF-1的基因表達明顯高于幼兔期;幼兔期和育成兔期WHBE兔的日糧適宜粗蛋白水平應在16%～18%。

結果表明，IGF-1和PEPCK基因都與日糧粗蛋白水平密切相關，表達豐度與日糧粗蛋白水平的變化趨勢較一致，本研究同時為今后準確確定兔日糧粗蛋白水平提供了檢測依據。

(本文圖2見彩插6。)

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Relationship of Dietary Crude Protein and G row th Stages w ith the Expression of Hepatic Functional Genes in WHBE Rabbits

LV Jian－min1，LIU Yue－huan2
(1.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China; 2.Zhejiang Center of Laboratory Animals，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of dietary crude protein(CP)level on hepatic functional genes expression during the growing and finishing periods in WHBE rabbits.M ethods Twenty rabbits were used in each stage according to a two－way trail.The rabbits in both periods were divided into five equal groups and fed with the diets of equal digestible energy but different CP contents(12%，14%，16%，18%and 20%).After a one－month feeding trail，the expression abundance of hepatic IGF-1 and PEPCK-C genes in the rabbits was determined by real－time PCR.Results The growth stages had significant effect on hepatic IGF-I mRNA expression，with a higher expression abundance in the finishing period，compared with that in the growth period.The IGF-I gene expression abundance was higher in rabbits receiving 16% or 18%CP than that of lower CP levels.Hepatic PEPCK-C mRNA was also highest at 16%CP level，but there were no significant differences between growing and finishing periods.ConlusionThere is a significant relationship between the expression of the two genes and dietary CP.The expression of IGF-I mRNA，but not PEPCK–C mRNA，is closely related to different growth stages.

Diet;Crude protein;Grow th stage;WHBE rabbit;Gene expression

R－33

A

1005－4847(2010)03－0208－04

2009－10－12

浙江省科技廳資助項目(2008F80003);浙江省衛生廳資助項目(2006A94)。

呂建敏(1971－)，女，副研究員，博士，研究方向:實驗動物營養與免疫方面的科研工作。E－mail:jiaminvv@yahoo.com.cn

劉月環(1974－)，女，副研究員，碩士，研究方向:生物技術與實驗動物育種.。E－mail:yuehuanliu@163.com