三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定

閻斌倫，秦國民，暴增海，張曉君，畢可然，秦蕾

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定

閻斌倫，秦國民，暴增海，張曉君，畢可然，秦蕾

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

從養殖病死三疣梭子蟹肝胰臟及心臟血淋巴液中分離到大量優勢生長的細菌，人工感染試驗證明分離菌對三疣梭子蟹有較強的致病性；對分離菌進行了形態特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物學性狀及16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定。菌株（JGX080708-1）所擴增的16S rRNA基因序列長度為1 453bp（GenBank 登錄號：FJ824663），所擴增的gyrB基因序列長度為1 191bp（GenBank 登錄號：GQ372985）；兩種基因序列在NCBI通過blast檢索，結果均與弧菌屬細菌的基因序列自然聚類；根據分離菌的表型及分子特征，判定分離菌為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]。分離菌的藥敏試驗結果顯示，對供試49種抗菌藥物中的安曲南等42種藥物高度敏感，對林可霉素敏感，對青霉素G等6種藥物耐藥。

三疣梭子蟹；副溶血弧菌；16S rRNA基因；gyrB基因

Abstract:Dominant bacteria were isolated from diseased Portunus trituberculatus L.,and have strong pathogenicity to Portunus trituberculatus L.by artificial challenge.The phenotypic biological characters were examined,including morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics; and the activity of extracellulase and hemolysin.The molecular identification were also conducted,and the 16S rRNA and gyrB genes were partially sequenced and compared with sequences deposited in databases,moreover molecular phylogenetic trees were constructed.The sequenced 16S rRNA gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.FJ824663)is 1,453bp in length,and the sequenced gyrB gene of strain JGX080708-1 (GenBank accession No.GQ372985)is 1,191bp in length.Blasting of 16S rRNA and gyrB genes in NCBI showed high homogeneity between the isolates and Vibrio sp.from GenBank database.The results showed that the identified strains belonged to Vibrio parahaemolyticus [(Fujino et al 1951)Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]of Vibrio (Pacini 1954)based on their phenotypic and molecular characteristics.Drug resistance of isolates to 49 antimicrobial agents was detected,and the results showed that isolates were high sensitive to 42 agents including aztreonam,and also sensitive to lincomycin,furthermore they were resistant to 6 agents including penicillin G.

Keywords：Portunus trituberculatus L.; Vibrio parahaemolyticus; 16S rRNA gene; gyrB gene

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，是一種大型海產經濟蟹類，廣泛分布于東南亞、東亞、非洲、美洲及澳大利亞等地的海域內，中國沿海從南至北均有分布。三疣梭子蟹肉質鮮美，營養豐富，是人們極為喜愛的水產品，同時也是主要的出口創匯品種，隨著梭子蟹人工繁育和養殖技術的突破，養殖發展迅猛，已成為繼中國對蝦以后中國海水甲殼類養殖的主導品種之一，但由于養殖設施及管理不規范、養殖大環境逐日惡化等因素的影響，導致病害頻發，經濟損失嚴重。據王國良等報道溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)可引起三疣梭子蟹肌肉乳化病[1]；王高學等報道引起三疣梭子蟹“牛奶病”的病原為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)[2]；許文軍等認為三疣梭子蟹“乳化病”由假絲酵母菌(Cnadida oleophila)感染引起[3]。

2008年7月，對江蘇贛榆某三疣梭子蟹養殖場所發生的疾病進行了檢驗，病蟹主要表現為常靠近岸邊緩慢游動，體色發紅，以附肢最為明顯，剝開背甲檢查，鰓較混濁且附有污物，肝胰臟色淡。經用顯微鏡對病梭子蟹肌肉、肝胰臟及鰓的檢驗，未發現致病性寄生蟲，隨機取4只被檢病蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液做細菌學及致病性檢驗，結果表明其病原為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]，盡管副溶血弧菌作為水生動物條件致病菌已多有報道，但目前尚未見有引起三疣梭子蟹感染發病的報道。為豐富該菌在宿主范圍、生物學性狀及分子生物學等方面的內容，進行了副溶血弧菌對三疣梭子蟹的致病性及其形態特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性、16S rRNA基因和gyrB基因序列與系統發育學分析、對抗菌類藥物的敏感性等系統研究，旨在對該菌的有效檢驗及深入研究等提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細菌分離

病情嚴重但尚未死亡蟹（4只）經多次用生理鹽水沖洗后又經75%酒精棉擦拭消毒，以其肝胰臟及心臟血淋巴液為樣品，先經抹片后革蘭氏染色鏡檢細菌；再用普通營養瓊脂及 Zobell 2216E海水培養基做劃線接種分離培養（28℃培養48 h檢查）細菌，取分離菌移接于普通營養瓊脂及Zobell 2216E海水瓊脂培養基斜面（28℃培養24 h）做純培養供檢驗用。

1.2 人工感染試驗

試驗用蟹選用2個月大小的健康幼蟹。將供試菌株(JGX080708-1)接種于含鹽1%的普通營養肉湯，28 ℃過夜培養后作為供試菌液，采用浸浴及腿部肌肉注射兩種感染方式。腿部肌肉注射感染：每只接種0.2 mL（菌液濃度調至約3×107CFU/mL），共接種 10只；同時腿部肌肉注射同劑量、同批無菌營養肉湯做對照；浸浴感染：分別取25 mL、50 mL、100 mL的供試菌液（菌液濃度約1×108CFU/mL）加至1 000 mL的試驗用海水中使活菌數分別達到2.5×106CFU/mL、5×106CFU/mL、1×107CFU/mL 3個不同濃度，分別浸浴感染健康幼蟹，每組浸浴感染15只幼蟹，同時無菌營養肉湯浸浴幼蟹做對照；全部試驗重復進行兩次。試驗蟹均隔離養殖于試驗水族箱中，觀察其感染后的發病與死亡情況，以引起試驗幼蟹發病死亡并能重新分離回收到原感染菌作為分離菌致病性的判定指標。

1.3 細菌鑒定

1.3.1 形態與菌落特征觀察及理化特性檢查取純培養菌分別移接于2 216 E海水瓊脂斜面置28 ℃培養20 h，制備涂片標本進行革蘭氏染色做形態特征檢查；純培養菌接種于2 216 E海水瓊脂及硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(TCBS)培養基，置28 ℃培養24 h，檢查生長情況。

取純培養菌，分別接種于細菌理化特性鑒定用培養基中，按常規進行氧化酶、接觸酶、糖（醇及苷）類代謝、H2S、吲哚、MR、V-P試驗、硝酸鹽還原、OF試驗、枸櫞酸鹽利用（Simmons）等較系統的理化特性測定，主要參照《常見細菌系統鑒定手冊》[4]進行；分離菌的胞外蛋白酶活性、脂酶活性、淀粉酶活性、尿素酶活性及溶血活性采用平板檢驗方法，明膠酶活性采用試管液化方法。主要參照《人及動物病原細菌學》[5]進行。

1.3.2 16S rRNA 基因序列測定與系統發育學分析

1.3.2.1 PCR 模板DNA的制備 取純培養菌分別接種于含鹽1%的LB肉湯中28 ℃培養16 h，按小量細菌基因組 DNA抽提試劑盒（上海賽百盛基因技術有限公司產）所述方法提取 DNA作為PCR模板DNA。

1.3.2.2 16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴增與測序 16S rRNA基因PCR擴增的兩個引物分別為：27F（正向引物）：5'-AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG-3'，1492R（反向引物）：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'[6]；gyrB基因PCR擴增的兩個引物分別為：UP1（正向引物）：5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3'，UP2r（反向引物）：5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCRTCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3'[7]。試驗方法參照張曉君等（2009）[8]。

1.3.2.3 16S rRNA和gyrB 基因序列系統發育樹構建 對分離菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列通過 NCBI的 Blast檢索系統（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行序列同源性分析，并使用ClustalX軟件與從GenBank數據庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用MEGA3(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)及 PAUP4.0最大簡約法（maximum parsimony，MP）構建MP樹，并通過 Bootstrap 法（1 000次重復）檢驗。

1.3.3 菌種分類位置確定 根據細菌形態、培養及理化特性測定的結果，主要依據《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.9th ed》[9]、《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[10]及有關資料，并結合細菌發育學分析的結果，進行分離菌的種屬分類位置判定。

1.4 藥物敏感性測定

經鑒定后的菌株，用常規瓊脂擴散（K-B）法進行對常用抗菌類藥物的敏感性測定，以是否出現抑菌圈及抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標[11]。

2 結 果

2.1 病變組織中的細菌與細菌分離

在4只被檢三疣梭子蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液中，均存在大量革蘭氏陰性、排列不規則，多數散在、偶爾成雙排列，無芽孢、大小多在0.4～0.8 μm×1.0～2.0μm 的桿菌。

自4只被檢三疣梭子蟹的肝胰臟中均分離到了大量同種細菌。培養24 h檢查其菌落特征為圓形光滑、不透明、隆起、邊緣較整齊、直徑多在0.5 mm左右，48 h的菌落直徑多在1.0 mm左右。隨機取 2個菌落做純培養，其編號為：JGX080708-1～2。

2.2 分離菌的致病性

在兩次重復進行的人工感染試驗中，分離菌(JGX080708-1)經浸泡及肌肉注射感染健康幼蟹后，供試幼蟹在5 h至12 h全部死亡，部分死蟹出現明顯的附肢發紅。兩種感染方式的對照組幼蟹在48 h觀察期內均正常；取上述不同途徑感染死亡蟹的肝胰臟及心臟血淋巴液，分別做抹片經革蘭氏染色鏡檢細菌，結果發現均有大量在形態特征上同原感染菌的細菌；同時均分離到了原感染菌的菌落，取感染死亡蟹的分離菌落做純培養2株，分別進行形態特征及主要理化特性指標的復核鑒定，結果均與原感染菌一致。試驗證明分離菌為本次引起三疣梭子蟹大量死亡的病原菌且具有相當強的致病性。

2.3 形態特征與培養特性

2株純培養菌的形態一致，均為革蘭氏染色陰性、桿狀、散在（個別成雙）、無芽孢、大小多在 0.3 ～ 0.8μm×1.0～ 2.0 μm 的細菌。在 2216E 海水瓊脂培養基上邊緣較整齊、隆起、光滑、濕潤、不透明、直徑在2 mm左右；在TCBS瓊脂培養基上，28 ℃培養24 h為圓形光滑、稍隆起、表面有光澤、直徑多在1.2mm左右的綠色菌落，生長良好。

2.4 理化性狀

分離菌所測主要理化性狀的反應結果一致（見表1）。酶活性實驗結果表明，2株供試菌的胞外產物具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，但不具有脲酶和明膠酶活性；在含 7%家兔脫纖血液營養瓊脂培養基上，呈β型溶血現象。

2.5 16S rRNA 基因序列與系統發育學

分離菌（JGX080708-1）所擴增的16S rRNA基因序列長度為 1 453 bp（GenBank 登錄號：FJ824663）；所擴增的gyrB基因序列長度為1 191 bp（GenBank 登錄號：GQ372985）。

將JGX080708-1株的16S rRNA基因序列在國際互聯網上進行同源性檢索，結果與弧菌屬細菌的16S rRNA基因序列自然聚類,檢索出的弧菌有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、需鈉弧菌(Vibrio natriegens)及坎氏弧菌(Vibrio campbellii)，供試菌與這些弧菌的的基因序列相似性均可達到98%至99%。選取了檢索出的部分菌株和1株外圍菌（嗜水氣單胞菌，登錄號：AF468055）的16S rRNA基因序列進行系統發育學分析，其MP系統發育樹如圖1所示，由圖1很難將分離菌進行歸屬分類。將分離菌（JGX080708-1）所擴增的gyrB基因序列在NCBI通過Blast進行同源性檢索，結果檢索出的均為弧菌屬細菌的gyrB基因序列，主要包括副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），相似性在98%～99%；另外檢索出的有溶藻酸弧菌（V.alginolyticus）、哈氏弧菌(V.harveyi)、坎氏弧菌（V.campbellii）、需鈉弧菌(V.natriegens)及輪蟲弧菌（V.rotiferianus），分離菌的gyrB基因序列與這些弧菌的相似性在 84%～88%，未達到種的要求。選擇一株嗜水氣單胞菌的 gyrB基因序列（登錄號：AF208258）作為外圍菌進行系統發育學分析，其MP系統發育樹如圖2所示。在圖2的系統發生樹中，分離菌（JGX080708-1）和選擇的10株副溶血弧菌聚為一個大分支，且自舉值為100%。

表1 分離菌的理化特性結果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of isolates

圖1 JGX080708-1株16S rRNA基因序列系統發育樹 (圖中AF468055至EU660312為菌株在NCBI的登錄號,數字為自舉值)Fig.1 Phylogenetic tree based on JGX080708-1 16S rRNA genesequences (AF468055～ EU660312 were database accession numbers in NCBI,and numbers above branches in the tree are bootstrap values)

2.6 菌種分類位置

結合形態觀察、普通的生理生化特征、16S rRNA及gyrB基因的分子特征，判定分離菌為弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus（Fujino et al 1951）Sakazaki Nakamura and Takizawa 1963]。

圖2 JGX080708-1株gyrB基因序列系統發育樹 (圖中AF208258至FM999818為菌株在NCBI的登錄號,數字為自舉值)Fig.2 Phylogenetic tree based on JGX080708-1 gyrB gene sequences(AF208258～ FM999818 were database accession numbers in NCBI,and numbers above branches in the tree are bootstrap values)

2.7 藥物敏感性

2株分離菌對供試49種抗菌類藥物敏感性株間無差異，均對安曲南等42種藥物高度敏感（抑菌圈直徑在20～60 mm）；對林可霉素敏感（抑菌圈直徑在12 mm）；對青霉素G等6種耐藥（抑菌圈直徑在0～8 mm）；具體結果見表2。

表2 藥敏紙片名稱和規格及病原副溶血弧菌的藥物敏感性Tab.2 Name and type of discs and antimicrobial sensitivity of pathogenic V.parahaemolyticus

3 結語與討論

副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)廣泛存在于世界各地近海岸的海水、海底沉積物及海生動物中，在河口入海處和鹽堿地區也可以分離到。已有研究資料表明，副溶血弧菌可引起人和動物（主要是水產養殖動物如魚、蝦、蟹、貝等）的感染發病，因此也被認為是一種人與水產養殖動物共染的病原菌。有記述該菌可引起大黃魚、斑節對蝦、對蝦、河蟹、鋸緣青蟹、九孔鮑及文蛤等的感染發病[12-19]。此外，副溶血弧菌在人的感染主要為腸炎或食物中毒，自1950年藤野從日本大阪市發生的食物中毒病例分離到副溶血弧菌以來，世界許多國家如日本、中國、澳大利亞、印度、美國、越南、泰國、多哥、馬來西亞、新加坡、俄羅斯、巴拿馬、新西蘭、羅馬尼亞、墨西哥等均陸續報告了副溶血弧菌食物中毒或腸炎。本次通過對發病三疣梭子蟹肝胰臟及心臟血淋巴液抹片直接染色發現細菌，并有規律地分離到優勢生長的細菌，人工感染試驗能引起健康幼蟹的發病與死亡并回收到原感染菌等方面的研究，以及對分離菌進行了主要理化特性方面較系統的檢驗及系統發育學分析，表明所檢出的細菌為副溶血弧菌且為被檢病蟹的相應病原菌，進一步表明了該菌在水產養殖動物中的廣泛致病作用。

細菌核糖體中的16S rRNA常用于細菌的鑒定與分類研究，該基因序列幾乎可以對所有的細菌進行屬水平上的鑒定[20]，但由于16S rRNA在進化中高度保守，對于種間水平的鑒定往往分辨率不足,對相似率極高的近緣種無法作進一步的區分[21]。本次對于分離菌在進行常規的形態特征、理化特性等表型生物學性狀檢驗的同時，又進行了16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定，比較了16S rRNA和gyrB兩種基因對副溶血弧菌的鑒別能力。分離菌（JGX080708-1）16S rRNA基因序列在NCBI通過blast檢索，檢索結果為5種弧菌，即副溶血弧菌、哈氏弧菌、溶藻酸弧菌、需鈉弧菌及坎氏弧菌，且分離菌與這些弧菌的16S rRNA基因序列相似性均達到了98%～99%，均可達到種的要求，在系統發生樹中（圖 1），JGX080708-1未與上述5種弧菌的任何一種聚為一個類群，本研究表明在副溶血弧菌分子鑒定中，用16S rRNA基因序列很難將其與屬內親緣關系很近的種區分開。分離菌(JGX080708-1)gyrB基因序列在NCBI通過blast檢索，檢索結果為6種弧菌，即副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、哈氏弧菌、坎氏弧菌、需鈉弧菌及輪蟲弧菌，分離菌的gyrB基因序列除與副溶血弧菌的相似性達到98%～99%外，與其他弧菌的相似性均只有84%～88%，未達到種的要求，且在系統發生樹中（圖2）也明顯地與選擇的10種副溶血弧菌聚為一個類群。本研究進一步表明在副溶血弧菌的檢測和鑒別方面，編碼DNA解旋酶B亞單位的gyrB基因比核糖體中的16S rRNA基因更具優越性。

在副溶血弧菌對抗菌類藥物敏感性的研究方面，劉葒等(1999)報道分離于斑節對蝦“紅體病(red body disease)”的副溶血弧菌對氟哌酸、紅霉素、青霉素和強力霉素較為敏感[13]；李文寬等(1999)報道引起遼寧地區河蟹暴發性流行病的副溶血弧菌對呋喃唑酮、磺胺、鏈霉素、卡那霉素、磺胺+甲氧芐氨嘧啶敏感[16]；毛芝娟等(2001)報道分離于鋸緣青蟹的副溶血弧菌對氯霉素、環丙沙星和慶大霉素等抗菌藥物表現出強敏感性，對諾氟沙星、磺胺甲異噁唑等中度敏感，對頭孢唑啉、呋喃唑酮等不敏感，中草藥五倍子和五味子也有較強的抑菌作用[17]；張朝霞等(2001)報道分離于九孔鮑的副溶血弧菌對鏈霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、妥布霉素、強力霉素、多黏菌素B、復方新諾明、磺胺甲基異噁唑等藥物高度敏感，對四環素、新霉素、頭孢噻肟、環丙沙星等中度敏感，對紅霉素、新生霉素、萬古霉素、氟哌酸、呋喃唑酮、氨芐青霉素、呋喃妥因等耐藥[18]；本次對分離于三疣梭子蟹的副溶血弧菌進行的對供試 49種抗菌類藥物的敏感性測定，結果對安曲南等42種藥物高度敏感（抑菌圈直徑在20～60 mm）；對林可霉素敏感（抑菌圈直徑在12 mm）；對青霉素G等6種耐藥，這些可作為在藥物防治副溶血弧菌感染時選擇用藥及對副溶血弧菌耐藥規律研究的參考。

副溶血弧菌作為人食物中毒和腸炎以及水產養殖動物的病原菌已被確認，目前對于該菌的毒力因子尚在研究之中，其中較為明確的是耐熱性溶血毒素(TDH)以及不耐熱的與 TDH相關的溶血毒素(TRH)；副溶血弧菌的胞外產物(ECP)具有多種酶活性，單獨注射感染即可導致中國對蝦的嚴重發病及死亡[22]；此外，研究發現尿素酶與副溶血弧菌的致病性之間存在一定關系，以往認為副溶血弧菌的尿素酶為陰性，尿素酶陽性的菌株與人的感染聯系不大，但有許多實驗證實尿素酶陽性菌株與 TRH之間呈正向聯系。本次通過對引起三疣梭子蟹感染發病的副溶血弧菌進行胞外酶活性及溶血活性檢測，表明本次分離的病原副溶血弧菌具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，但不具有脲酶和明膠酶活性，且具有溶血活性，可為副溶血弧菌毒力因子的深入研究提供參考。

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Isolation and identification of Vibrio parahaemolyticus from diseased Portunus trituberculatus L.

YAN Bin-lun,QIN Guo-min,BAO Zeng-hai,ZHANG Xiao-jun,BI Ke-ran,QIN Lei
(College of Ocean,Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)

S945; Q939.1

A

1001-6932(2010)05-0560-07

2009-03-25；

2009-12-29

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2006BAD09A01)；江蘇省水產三項工程項目（PJ2010-58）；淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室研究基金（2008HS016）資助

閻斌倫（1962－），男，教授，主要從事海洋生物技術與應用研究。電子郵箱：E-mail:yanbinlun@yahoo.com.cn