劉志東 許紹發 肖寧 宋長興 張海青 李福根

肺癌是目前腫瘤致死的第一位病因，80%以上的肺癌患者被確診時已屬中晚期，5年生存率僅14%[1]。侵襲和轉移是造成肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因[2]。隨著分子生物學技術的發展，人們在不斷地尋找、篩選與肺癌侵襲和轉移相關的腫瘤標記物，以更好地判斷肺癌患者的進展情況，并期待能將其應用于治療，提高治療效果。

白細胞介素-8（interleukin-8, IL-8）是Yoshimura等[3]于1987年首次從脂多糖植物血凝素刺激人血單核細胞培養上清液中發現的一種趨化因子，以前人們發現它有激活和趨化嗜中性粒細胞的作用，對炎癥和免疫過程有著重要的調節作用，近年來有文獻報道腫瘤細胞也可分泌IL-8，并發現IL-8可以促進新生血管形成[4]、上調基質金屬蛋白酶的表達[5]，與惡性腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關。

細胞外基質和基底膜是阻止腫瘤侵襲和轉移的重要組織屏障，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）是降解細胞外基質最重要的酶類，在腫瘤的侵襲和轉移中起著重要的作用。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是基質金屬蛋白酶中的一員，分子量為95 kDa，能降解破壞ECM中最主要的組分IV、V型膠原和明膠[6]來增強腫瘤的侵襲性和轉移能力。

本研究運用酶聯免疫吸附實驗、免疫組織化學兩種方法，分別檢測治療前非小細胞肺癌患者的血清及肺癌組織IL-8、MMP-9的表達水平，分析IL-8、MMP-9的表達與肺癌患者臨床病理因素之間的聯系，分析IL-8、MMP-9表達的相關性，探討IL-8參與非小細胞肺癌轉移的機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料 ①血清組：非小細胞肺癌患者：141例，男性107例，女性34例，年齡31歲-82歲，中位年齡61歲，為連續選取2007年1月-2007年11月到北京胸科醫院胸外科及呼吸科就診的患者。患者均經細胞學或組織學病理證實為非小細胞肺癌，未經手術、放療、化療及生物靶向治療等特異抗腫瘤治療，無心腦血管并發癥，近期無急性感染。患者經血清IL-8、MMP-9檢測后行手術治療者95例，進行其它治療者46例。非小細胞肺癌患者的臨床病理分期及遠處轉移的判斷遵循國際抗癌協會（International Union Against Cancer, UICC）1997年公布的肺癌TNM分期。良性疾病對照組：40例，男性25例，女性15例，年齡15歲-80歲，中位年齡52歲，為同期連續選取在北京胸科醫院胸外科及呼吸科就診的患者，病理類型包括肺結核8例、急性肺炎8例、阻塞性肺疾病4例、支氣管擴張12例、肺良性腫塊8例。健康對照組：40例，男性30例，女性10例，年齡25歲-68歲，中位年齡56歲，均為無心、肝、肺和腎等重要器官疾病，肝腎功能正常者。

②免疫組化組：非小細胞肺癌：為血清組非小細胞肺癌患者中行手術治療的患者，共95例，男性79例，女性16例，年齡31歲-79歲，中位年齡60歲。良性疾病：為血清組良性疾病對照患者行手術治療者21例。正常肺組織：距癌組織＞5 cm，經HE染色證實無癌細胞浸潤的肺組織視為正常肺組織，本實驗取25例。

1.2 酶聯免疫吸附實驗 患者和健康人均在清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，取血后當日離心（1 000 rpm）10 min，分離血清，置于-40oC保存待測定。鼠抗人IL-8、MMP-9單克隆抗體購自美國R＆D公司，經晶美生物工程有限公司包埋成ELISA試劑盒，血清IL-8、MMP-9水平測定嚴格按ELISA試劑盒說明書進行，由專用電腦測量出具體數值。所有病例均雙標本測定，取中間值。1.3 免疫組化（SP法）

1.3.1 免疫組化方法 所有標本均用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成厚5 μm的切片，采用免疫組化SP法進行IL-8、MMP-9染色。鼠抗人IL-8、MMP-9單克隆抗體購自美國R＆D公司，SP試劑盒、DAB顯色劑購自泉暉生物技術有限公司。免疫組化染色按SP試劑盒操作說明進行，以高壓加熱修復法進行抗原修復，4oC過夜，采用PBS代替一抗做陰性對照，陽性對照采用已知實驗中證實對本實驗所用抗體呈陽性染色反應的非小細胞肺癌組織陽性切片。

1.3.2 結果判定 每個切片隨機觀察5個高倍鏡視野，每個高倍鏡視野計數200個腫瘤細胞，分別由兩位病理科醫生對染色結果進行評判，IL-8、MMP-9陽性著色定位于細胞漿或細胞膜，細胞被染色為棕黃色或棕褐色為陽性，按著色強度計分：無著色為0分；棕黃色清晰為2分；著色強度介于二者之間為1分，棕褐色為3分。按著色細胞百分數計分：著色細胞＜30%為0分；≥30%但＜60%為1分，≥60%為2分。將著色細胞著色強度計分與著色百分數計分相加，總計0分或1分為（-），總計2分或3分為（+），總計4分為（++），總計5分為（+++）。

1.4 統計學處理 血清IL-8、MMP-9水平所測數據采用SPSS 13.0軟件包進行分析，經正態性檢驗，IL-8、MMP-9血清濃度數據成偏態分布，多組間數據差異比較應用Kruskal-Wallis H檢驗，兩組間差異比較用Mann-Whitney U檢驗。免疫組化IL-8、MMP-9的表達與臨床病理特征關系的比較，采用四格表或行×列表χ2檢驗。組間相關性采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。診斷效能的評價采用ROC曲線計算靈敏性和特異性，并計算Youden's指數、陽性預測值、陰性預測值。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌患者血清IL-8、MMP-9表達水平與臨床病理特征的關系 如表1所示，非小細胞肺癌患者（包括行手術治療和未行手術治療的共141例患者）血清IL-8、MMP-9水平明顯高于肺良性疾病對照組及健康對照組，其差異有統計學意義。非小細胞肺癌患者血清IL-8、MMP-9表達水平隨著臨床TNM病理分期的升高而升高，其差異有統計學意義。在經手術治療的95例非小細胞肺癌患者中，血清IL-8、MMP-9的表達水平與腫瘤的淋巴轉移和遠處轉移有關，有淋巴轉移或遠處轉移的表達水平高于無轉移的患者，其差異有統計學意義。MMP-9的表達水平與腫瘤的T分期相關，但血清IL-8表達水平與腫瘤T分期相關性卻無明顯的統計學意義（P=0.080）。血清IL-8、MMP-9的表達水平與腫瘤大小無明顯的統計學意義（P=0.071）。從表1還可看出，非小細胞肺癌患者的血清IL-8 、MMP-9水平與肺癌的病理類型（本實驗含鱗癌40例，腺癌50例，其它病理類型包括腺鱗癌、大細胞癌共5例，由于數據相差懸殊，經檢驗其結果無統計學意義，而鱗癌和腺癌的比較結果有統計學意義，故在表中僅列出了鱗癌和腺癌的例數）、分化程度、腫瘤位置無關，且與患者的性別、年齡、吸煙史也無關。

2.2 肺癌組織中IL-8、MMP-9免疫組化表達水平與臨床病理特征的關系 免疫組化結果如圖1和圖2所示，表2（本表結果為計量資料，將TNM分期、腫瘤大小及淋巴結分開統計后，經統計檢驗發現有些亞組數值太小，達不到統計要求，故不得不將TNM分期的III期、IV期合并，T3和T4合并，淋巴結分組中N1、N2、N3合并）所示，非小細胞肺癌組織的IL-8、MMP-9水平明顯高于良性疾病肺組織及健康肺組織，其差異有統計學意義。非小細胞肺癌組織IL-8、MMP-9的表達水平隨著臨床TNM病理分期的升高而升高，其差異有統計學意義。非小細胞肺癌組織IL-8、MMP-9的表達水平與腫瘤的淋巴轉移有關，有淋巴轉移的表達水平高于無轉移的肺癌組織，其差異有統計學意義。但二者與遠處轉移的相關性卻無顯著的統計學意義。從表2還可以看出，非小細胞肺癌組織的IL-8、MMP-9水平與肺癌的腫瘤大小、病理類型（僅包括鱗癌和腺癌）、分化程度、腫瘤位置無關，且與患者的性別、年齡、吸煙史也無關。

圖 1 IL-8在肺腺癌和鱗癌組織中表達的免疫組化染色。IL-8蛋白表達于肺癌細胞胞漿和胞膜，蘇木素染色（SP, ×400）。A：陰性對照；B：腺癌染色陽性；C：鱗癌染色陽性。Fig 1 IL-8 expression in lung adenocarcinoma and squamous carcinoma. Immunohistochemical staining of IL-8 protein was located in cytoplasm and cell membrane (SP, ×400). A: negative control; B: adenocarcinoma positive; C: squamous positive.

圖 2 MMP-9在肺腺癌和鱗癌組織中表達的免疫組化染色。MMP-9蛋白表達于肺癌細胞胞漿和胞膜，蘇木素染色（SP, ×400）。A：陰性對照；B：腺癌染色陽性；C：鱗癌染色陽性。Fig 2 MMP-9 expression in lung adenocarcinoma and squamous carcinoma. Immunohistochemical staining of MMP-9 protein was located in cytoplasm and cell membrane (SP, ×400). A: negative control; B: adenocarcinoma positive; C: squamous positive.

表 1 非小細胞肺癌患者血清IL-8、MMP-9表達水平與臨床病理特征的關系Tab 1 The relationship between serum IL-8 and MMP-9 and the clinicopathological characteristics

表 2 肺癌組織中IL-8、MMP-9免疫組化表達水平與臨床病理特征的關系Tab 2 The relationship between tissue IL-8 and MMP-9 expressions and the clinicopathological characteristics

2.3 95例手術非小細胞肺癌患者血清及肺組織中IL-8、MMP-9表達水平、肺組織IL-8、MMP-9表達水平與臨床病理T、N、M特征的相關性 從表3可以看出，在各種因素的相關系數分析中，非小細胞肺癌患者組織中IL-8、MMP-9表達的相關性最強（r=0.765），其次為血清IL-8的表達與淋巴轉移的相關性（r=0.515），血清中IL-8、MMP-9表達也具有較強的相關性（r=0.445）。

2.4 IL-8、MMP-9作為腫瘤標志物對非小細胞肺癌病情進展的評價效能 從表4可以看出，但IL-8、MMP-9對于預測早期肺癌（尚未出現淋巴轉移）的發生效能較差（當特異性為75%左右時，其敏感性僅為21.1%和31.6%，約登指數及陽性預測值、陰性預測值也較低）。IL-8對于預測肺癌的淋巴轉移具有較好的敏感性（76.6%）和特異性（79.2%），約登指數及陽性預測值、陰性預測值也較高。

3 討論

本研究發現IL-8、MMP-9在非小細胞肺癌患者血清及腫瘤組織中的表達水平與肺癌的進展密切相關，二者之間也有密切的相關性。

腫瘤是依賴血管發生的，并且腫瘤的生長需要伴隨血液供應的增加，無論是原發部位還是轉移病灶，腫瘤的持續生長必須依賴新生血管的形成[7]，在局部缺乏毛細血管增殖的條件下，腫瘤的生長不會超出2 mm-3 mm。新生血管不僅提供了腫瘤生長所必須的營養，為轉移提供了通路，而且新生血管基底膜呈節段性分布，比正常組織的成熟毛細血管對瘤細胞有更高的親和性，所以血管新生是影響腫瘤大小、局部和遠處轉移的重要因素。

表 3 95例手術非小細胞肺癌患者血清及肺組織IL-8、MMP-9表達水平與臨床病理T、N、M特征的相關性Tab 3 Spearman analysis of the correlation between IL-8, MMP-9 of serum and tissue and T, N, M status of 95 NSCLC patients

表 4 IL-8、MMP-9作為腫瘤標志物對非小細胞肺癌病情進展的評價效能Tab 4 Comparison of IL-8, MMP-9 performances as possible indicators of cancer presence and dissemination

1992年Strieter[8]在做兔角膜實驗中第一次發現IL-8具有促進血管形成的作用。Smith等[9]發現，支氣管肺癌腫瘤細胞內的IL-8含量較正常組織高4倍。后來Arenberg等[10]也發現IL-8參與NSCLC內新生血管的形成。目前已有多篇研究報道在胃癌[11]、胰腺癌[12]、結直腸癌[13]和乳腺癌[14]患者的腫瘤組織中IL-8水平表達明顯升高，本實驗檢測肺癌組織中IL-8的表達也得出了類似的結論。本研究顯示，從總體上看，非小細胞肺癌患者IL-8的血清水平和在組織中的表達水平均明顯高于良性疾病對照組及健康對照組，而且其水平隨著肺癌臨床TNM病理分期的升高而升高，其差異有統計學意義。但在血清IL-8檢測中，無淋巴轉移的I期肺癌患者與健康對照組及良性疾病對照組卻無明顯的差異，而且，不同肺癌T分期、不同腫瘤大小組的血清IL-8表達水平差異分別為P=0.080和P=0.071，雖有不同的傾向但并無顯著的統計學差異。這可能來自兩個原因：一方面，本實驗雖總例數較多，但分散至各組則例數較少，可能是例數不足，不能真正代表全體；另一方面，血清IL-8水平并不能直接反映組織中IL-8的表達：肺癌組織中局部IL-8水平增高，但只有少量能釋放入血，血清中的IL-8可來源于腫瘤細胞，也可來源于中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞，血清中炎性細胞分泌IL-8掩蓋了肺癌組織分泌IL-8的差異。

在肺癌患者中，血清IL-8水平與淋巴結轉移、遠處轉移相關，而且血清IL-8水平與淋巴轉移具有更強的相關性，在肺癌組織IL-8表達水平只與腫瘤的淋巴轉移有關，與遠處轉移的相關性無顯著的統計學意義。這一結果是IL-8的促血管形成作用所不能解釋的，仔細分析病例資料，遠處轉移的患者（IV期）幾乎均有較大范圍的淋巴轉移，所以本研究認為：IL-8、MMP-9的表達水平隨肺癌進展而升高的總趨勢主要是IL-8促淋巴生成作用的結果。

關于IL-8直接促進淋巴轉移機制，目前未見文獻報道。僅Krzystek-Korpacka等[15]報道食管鱗癌患者血清中IL-8和VEGF-C濃度具有明顯的相關性，而VEGF-C具有促進淋巴管生成的作用，因此IL-8可能是通過促進淋巴管形成的作用來誘導淋巴轉移的。因此進一步研究肺癌中IL-8和VEGF-C及淋巴轉移的關系將是極有價值的工作。本研究還發現一個有趣的現象，即淋巴轉移到N1患者血清中IL-8水平高于淋巴轉移到N2患者的水平，因此我們猜測，IL-8在腫瘤轉移的初期分泌較多，而在腫瘤轉移后期，特別是有遠處轉移時，IL-8分泌已較少。

腫瘤的轉移是一個主動過程，腫瘤細胞要脫離原發腫瘤組織，穿過細胞外基質和基底膜向淋巴管或血管中遷移，然后穿過血管基底膜，穿透血管腔，逃脫免疫監視，與遠離原發灶器官的血管內皮細胞粘附，離開血管，在被侵入的微環境中存活和生長[16]。在此過程中，腫瘤細胞至少3次與基底膜相互作用，粘著并破壞基底膜[2]，因此細胞外基質（extracellular matrix, ECM）和基底膜是阻止腫瘤侵襲和轉移的重要組織屏障。MMP是降解細胞外基質和基底膜最重要的酶類[17]。MMP-9屬于MMP家族，它能降解破壞ECM中最主要的組分IV、V型膠原和明膠[6]，已有文獻報道在食管癌[18]、胃癌[19]、結直腸癌[20,21]及乳腺癌[22]患者的腫瘤組織和血清中MMP-9表達水平明顯升高。本研究顯示，非小細胞肺癌患者MMP-9的血清水平和組織表達明顯高于良性疾病對照組及正常對照組，這與Kopczynska等[23]報道類似。

近年來研究表明，IL-8可上調MMP的表達。Inoue等[24]研究認為IL-8通過上調MMP-9的表達，而參與腫瘤細胞的浸潤和轉移。Watanabe等[25]在進行口腔鱗狀細胞癌試驗時發現用重組IL-8處理細胞可使MMP-7 mRNA和蛋白的表達增高，而用抗IL-8抗體處理細胞時發現MMP-7 mRNA和蛋白的表達被抑制。

關于IL-8上調MMP表達的機制，許多學者進行了研究。Luca等[26]發現在黑色素瘤SB-2細胞系中，IL-8可在基因轉錄水平上調MMP-2 mRNA的表達，根據以前Sozzani等[27]發現在人中性粒細胞中，IL-8可激活磷脂酶D（phospholipase D, PLD），Reich等[28]發現在腫瘤細胞內，PLD介導的信號轉導通路可誘導MMP-2的產生，他推測IL-8上調MMPs的可能機制為：細胞外的IL-8通過細胞膜表面受體激活細胞內的PLD介導的信號轉導通路，PLD通路將信號傳遞給細胞核，刺激MMPs的轉錄及表達。而Subhadeep等[29]發現在中性粒細胞中細胞外的IL-8通過細胞膜表面受體激活細胞內的磷脂酶C（phospholipase C, PLC）介導的信號轉導通路，PLC通路將信號傳遞給細胞核，刺激MMPs的轉錄及表達。本研究發現非小細胞肺癌患者組織和血清中IL-8、MMP-9表達均有明顯的相關性，組織中的相關性最強（r=0.765），而在血清中二者的相關性相對減弱（r=0.445），這可能是由于在局部組織，受其它因素影響較小，IL-8上調MMP-9表達更易體現，而血清中的MMP-9不全是由于腫瘤細胞分泌釋放入血的，單核細胞、間質細胞等細胞也可以分泌MMP-9，二者的相關性必然受到其它因素的影響。

根據以上的實驗結果，我們分析了IL-8、MMP-9作為腫瘤標志物對非小細胞肺癌病情進展的評價效能，如表4，可以看出，IL-8對于預測肺癌的淋巴轉移具有較好的敏感性和特異性，但IL-8、MMP-9對于預測早期肺癌（尚未出現淋巴轉移）的發生和遠處轉移的出現的效能較差。

綜上所述，本研究結果表明：IL-8、MMP-9表達水平與非小細胞肺癌的進展密切相關，特別是IL-8與肺癌的淋巴轉移具有明顯的相關性，其機制可能是通過上調MMP-9實現的，但具體機制有待進一步研究。血清IL-8水平對于預測肺癌的淋巴轉移具有較好的敏感性和特異性，可作為判斷肺癌淋巴轉移的參考。