HPLC法測(cè)定銀杏葉軟膠囊中總黃酮的含量

葉秀波 ，岑幗英 ，李瑞明

（1.廣州市海珠區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州 510220；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510080）

銀杏葉軟膠囊是由銀杏提取物與適量的基質(zhì)制成的軟膠囊，銀杏提取物中含有黃酮類化合物和銀杏總內(nèi)酯兩類生物活性物。其中，總黃酮類包括槲皮素、山奈素、異鼠李素等，共同作用于心腦和外周末梢血管系統(tǒng)，促進(jìn)血液循環(huán)和改善末梢血液的運(yùn)行，從而預(yù)防血管系統(tǒng)循環(huán)障礙所引起的各種癥狀。另外，黃酮類化合物有清除游離氧的抗氧化等藥理作用[1]。本文用HPLC法測(cè)定總黃酮的含量，為建立銀杏葉軟膠囊質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010高效液相色譜儀 （日本島津公司）；KQ-300超聲清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；色譜柱Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：10081-200406，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；山奈素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110861-200303，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；異鼠李素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110860-200205，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純，銀杏葉軟膠囊（批號(hào)：080510、080920、091026，廣州美麗康有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50）（用磷酸調(diào) pH 為 2.5），流速為 1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm[2]，柱溫為30℃。在本條件下，槲皮素、山奈素、異鼠李素能達(dá)到較好分離，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品適量加甲醇制成槲皮素濃度為 1.0 mg/ml、山奈素濃度為0.1 mg/ml、異鼠李素濃度為0.1 mg/ml的單一成分對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述槲皮素對(duì)照品貯備液4 ml、山奈素對(duì)照品貯備液4 ml、異鼠李素貯備液1 ml，置10 ml量瓶中用甲醇定容至刻度，搖勻，即得槲皮素濃度為0.4384mg/ml、山奈素濃度為0.042 2 mg/ml、異鼠李素濃度為0.010 0 mg/ml的混合對(duì)照品溶液[3-6]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品裝量差異下的內(nèi)容物2 g，精密稱定，加20 ml甲醇超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液加入1.5 mol/L鹽酸溶液20 ml，水浴回流3 h，冷卻后用甲醇定容至50 ml量瓶，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[3]。

2.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下槲皮素、山奈素、異鼠李素備用對(duì)照品溶液加甲醇配制成含一系列濃度的混合溶液：對(duì)照品溶液1（含槲皮素 0.050 mg/ml、山奈素 0.005 mg/ml、異鼠李素0.005 mg/ml），對(duì)照品溶液 2（含槲皮素 0.100 mg/ml、山奈素0.010 mg/ml、異鼠李素 0.010 mg/ml），對(duì)照品溶液 3（含槲皮素 0.150 mg/ml、山奈素 0.015 mg/ml、異鼠李素 0.015 mg/ml），對(duì)照品溶液4（含槲皮素0.300 mg/ml、山奈素0.030 mg/ml、異鼠李素0.030 mg/ml），對(duì)照品溶液 5（含槲皮素 0.400 mg/ml、山奈素0.040 mg/ml、異鼠李素0.040 mg/ml）。精密吸取上述對(duì)照品溶液各進(jìn)10 μl記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X（mg/g）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得槲皮素、山奈素、異鼠李素的回歸方程分別為：槲皮素Y=31 248 671X-15 558（r=0.999 5）；山奈素 Y=30 421 567X+614 692（r=0.999 9）；異鼠李素Y=24 180 214X-225 760（r=0.999 7）。結(jié)果表明槲皮素、山奈素、異鼠李素進(jìn)樣量分別在0.050～0.400、0.005～0.040、0.005～0.040 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別為1.8%、1.7%、1.6%。結(jié)果表明本法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取銀杏葉軟膠囊（批號(hào)：080510）的供試品溶液，分別于（0、1、2、4、8、12、24 h）進(jìn)樣 20 μl記錄峰面積，結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別為2.8%、2.5%、2.8%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)銀杏葉軟膠囊 （批號(hào)：080510）各6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，計(jì)算含量，再按總黃酮醇苷含量=（槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量）×2.51[2]計(jì)算，樣品中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量分別為2.33、0.19、0.06 mg/粒，總黃酮醇苷平均含量為6.46 mg/粒（RSD=1.5%）。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批號(hào)銀杏葉軟膠囊 （批號(hào)：080510）適量，按表1精密加入對(duì)照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery test(n=9)

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取3批銀杏葉軟膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl及供試品溶液20 μl，注入色譜儀，記錄峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算樣品中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量，并換算成總黃酮醇苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Content determination results of samples(%，n=3)

3 討論

在提取過(guò)程中，比較采用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）的混合溶液水浴加熱回流法、甲醇超聲提取、鹽酸加熱水解法三種不同的提取方法，結(jié)果表明鹽酸水解法效果較好，能將黃酮醇苷類成分水解完全。

為了使所檢測(cè)的色譜峰分離度好，出峰時(shí)間合理，試用甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）及甲醇-水（50∶50）（用磷酸調(diào)pH=2.5），結(jié)果選用甲醇-水（50∶50）（用磷酸調(diào) pH=2.5）作為流動(dòng)相時(shí)各個(gè)色譜峰的分離效果好。

[1]李冶,鄭偉文.銀杏葉提取物的藥理研究與臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志,2007,2(31)∶1452-1454.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京∶化學(xué)工業(yè)出版社,2005∶153.

[3]衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范手冊(cè)[S].北京∶清華同方電子出版社,2003.

[4]馬梅芳,呂文海.HPLC法同時(shí)測(cè)定南葶藶子飲片中槲皮素、山奈素及異鼠李素的含量[J].中國(guó)藥事,2009,(1)∶65-67.

[5]杜瑞芳,王雨梅,劉衛(wèi)東,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定沙棗中槲皮素和異鼠李素的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,4(19)∶831-832.

[6]丁立新,李春英,孫啟芬.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定小葉金錢草中槲皮素和山奈素的含量[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(5)∶458.