康萊特對小鼠肝癌細胞Hepa1-6增殖和凋亡的影響

武晉榮，趙和平

（1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西醫科大學第一醫院，山西太原 030001）

康萊特（KLT）注射液是從傳統中藥薏苡仁中提取的新型雙相廣譜中藥抗腫瘤藥物，臨床上多用其靜脈乳劑，研究表明[1-2]，KLT 具有阻滯腫瘤細胞有絲分裂，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，影響癌基因表達，抑制腫瘤新生血管生成，調節細胞因子水平以及逆轉多藥耐藥等作用，而且能明顯改善患者的生存質量[3-4]。目前KLT 對小鼠肝癌細胞Hepa1-6 抗腫瘤作用的機制還缺少全面的研究。本實驗旨在分析康萊特是否是通過抑制Hepa1-6 細胞增殖、誘導Hepa1-6細胞凋亡來發揮抑瘤作用，為其在臨床應用中提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 康萊特注射液（100 ml/瓶，浙江康萊特藥業有限公司，國藥準字：Z10970091）；DMEM 培養液為Invitrogen 公司產品，小牛血清、胰蛋白酶及噻唑蘭（MTT）均購自武漢博士德生物工程有限公司；青霉素、鏈霉素為HyClone公司產品。二甲基亞砜（DMSO）：天津市化學試劑公司。

1.1.2 主要儀器 ZS-2 板式酶標儀（中國航天工業總公司），SWCJ-FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），流式細胞儀，CO2細胞培養箱，普通臺式離心機。

1.2 細胞培養

小鼠Hepa1-6 肝癌細胞株購于中國農科院細胞庫，以含體積分數為10%胎牛血清的DMEM 培養基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規培養。隔天換液一次，3～4d 傳代一次。取對數生長期細胞制備單細胞懸液進行不同的實驗。

1.3 MTT法檢測細胞抑制情況

取對數生長期細胞稀釋為1×105/ml 密度每孔200 μl 移入 96 孔培養板中。 加入 KLT 組 B（10 ml/L）、C（20 ml/L）、D（30 ml/L）、E（40 ml/L）、F（50 ml/L）的 10%胎牛血清dMEM培養液。另設A 組（空白對照組，10%胎牛血清DMEM 培養液）。分別培養24、48、72 h， 實驗終止4h 前加入MTT 液（5 mg/ml）20 μl。 棄上清，加入dMSO 150 μl，振蕩 10 min 使結晶溶解，用酶標儀（波長490 nm）測定吸光度（OD）值，重復3次取平均值。藥物對細胞生長的抑制率：抑制率（IC）=（空白對照組OD 均值-用藥組OD 均值）/空白對照組OD 均值×100%。

1.4 光鏡觀察細胞形態學改變傳代試驗

取對數生長期細胞稀釋為1×105/ml 密度每孔1 ml 接種于放有蓋玻片的6 孔板中，細胞貼壁后，隨機分為四組，分別加入 KLT（B、D、F），并設 A 組作為對照（每孔總液量均為2 ml），培養48h 后取出覆蓋有細胞的蓋玻片，PBS 洗3次，浸入40g/L 多聚甲醛中固定15 min，PBS 洗2次， 常規蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察細胞結構變化。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡率

取對數生長期細胞消化成單細胞懸液置6 孔培養板，培養 24h 后棄上清，加入 KLT（B、D、F），每種濃度設平行4孔（即每種濃度重復4次），并設A 組作為對照，繼續培養48 h后，加入0.25%的胰酶1 ml 將細胞消化，置入離心管中，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清；PBS洗2次，離心、棄上清，加70%無水乙醇2 ml 固定，振蕩混勻，離心，棄上清，過300 目篩子，PBS 洗3次，加入1 ml PI工作液，4℃避光染色30 min，流式細胞儀分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0 軟件進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x ±s）表示，采用單因素方差分析及 LSD-t 檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLT對Hepa1-6細胞生長的抑制效應

Hepa1-6 細胞在KLT 不同劑量、時間作用后，MTT 法觀察細胞生長情況結果示：隨著KLT劑量的逐漸增加、作用時間逐漸延長，其細胞生長抑制率逐漸增加。各給藥組與A 組比較，差異均有統計學意義（均P<0.01）；各給藥組組間比較示：與 B 組比較，C 組與 B 組（P>0.05），D 組與 B 組（P<0.01）；與d 組比較，E 組與d 組（P>0.05），F 組與d 組（P<0.01）。 提示，KLT 對Hepa1-6 細胞的抑制作用呈劑量、時間依賴關系；并且KLT 以10、30、50 ml/L 作用時，細胞抑制率顯著，因此，后續實驗用此三種濃度進行。見圖1。

2.2 KLT對Hepa1-6細胞形態及傳代試驗的影響

光鏡示，Hepa1-6 胞質呈粉紅色，胞核呈深藍色。A 組細胞形態呈多邊形或三角形，偽足多、長，滿視野瘤巨細胞及核分裂相。隨著給藥濃度增加，細胞偽足漸回縮，細胞形態變小、圓，細胞輪廓清晰度增強，排列松散或聚集成團，細胞分裂相漸減少，瘤巨細胞漸減少。傳代試驗表明，A 組細胞生長快，分裂增殖旺盛，3～4d 傳代一次，隨著給藥濃度增加，傳代能力逐漸下降且失去傳代能力，出現懸浮現象。上述現象表明，細胞形態及傳代試驗與藥物濃度呈依賴性，見圖2。

2.3 KLT對Hepa1-6細胞凋亡的影響

不同劑量KLT 作用Hepa1-6 肝癌細胞48h 后， 均在G0/G1期前出現一個亞二倍體峰，且該峰隨著KLT 作用濃度的增高而升高（圖 3）。 經 KLT（B、D、F）作用 48h 后，細胞凋亡率分別為（7.86±0.40）%、（12.34±1.09）%和（28.67±0.85）%，而對照組僅為（2.88±0.30）%，各藥物組與對照組比較、各藥物組間比較，差異均有統計學意義（均P<0.01）。

3 討論

原發性肝癌系全球發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，且近年來發病率有上升趨勢[5]。目前臨床治療肝癌仍以手術、放療、化療為主，但70%～80%的患者就診時已失去手術最佳時期。臨床常用的西藥化療物雖有很強的癌細胞殺傷性，但藥物的毒副作用使體質較差的患者難以耐受，極大地降低了患者的生存質量。因此，臨床上尋求一種既能抑制肝癌的生長，又無明顯的毒副作用、提高患者生存質量的藥物迫在眉睫。

惡性腫瘤包括肝癌在內，共同生物學特征是細胞的失控增長，即細胞凋亡與細胞增殖失衡。因此，抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡已成為目前腫瘤綜合治療的重要途徑之一[6]。KLT注射液是從傳統中藥薏苡仁中提取的新型雙相廣譜中藥制劑，具有多靶點治療、提高晚期癌癥患者的生存質量和毒副作用小等優點，目前臨床已應用于非小細胞肺癌[7]、胃癌[8]、大腸癌[9]等惡性腫瘤的綜合治療中。本研究通過MTT法觀察，結果表明，KLT能夠有效抑制肝癌Hepa1-6細胞增殖，抑制率呈明顯的時間、濃度依賴性，且10、30、50 ml/L抑制作用明顯。

蘇偉賢等[8]將不同濃度的KLT作用于人SGC-7901胃癌細胞，研究發現隨著藥物濃度增加，胃癌細胞核漿比例顯著縮小，細胞惡性程度降低，細胞分化趨向良性；本研究細胞爬片HE染色示，發現給藥后Hepa1-6肝癌細胞偽足回縮，細胞變小、變圓，核分裂相減少，出現懸浮現象，傳代能力減弱，且呈濃度依賴性。進一步提示KLT可能在一定程度上能夠誘導腫瘤細胞向正常細胞分化。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定而出現的一種由多種凋亡相關基因控制的細胞自主的有序死亡，受細胞內源性基因、酶類和信號轉導途徑的調控。研究認為，細胞凋亡功能的抑制將導致腫瘤的發生[10]。因此，以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的重要策略之一[11-12]。本研究采用流式細胞術發現KLT可以誘導Hepa1-6肝癌細胞株發生凋亡，且凋亡峰隨著KLT作用濃度的增高而升高，細胞增殖受到抑制，提示KLT抗腫瘤作用可能通過其促凋亡機制來實現。

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