帽蕊木α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

康文藝,宋艷麗,張 麗

河南大學中藥研究所,開封 475004

帽蕊木α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

康文藝＊,宋艷麗,張 麗

河南大學中藥研究所,開封 475004

利用體外抑制α-葡萄糖苷酶模型,首次對植物帽蕊木葉、皮提取物和從中分離得到的化合物進行活性評價,并與陽性對照Acarbose進行比較。結果表明帽蕊木葉和皮提取物都具有很高抑制α-葡萄糖苷酶活性,且葉的活性要好于皮,同一部位的正丁醇和乙酸乙酯提取物的活性要好于石油醚提取物;從帽蕊木中得到的化合物莨菪內酯 (scopletin)的α-葡萄糖苷酶抑制活性 (I C50=35.03μg/mL)高于陽性對照 Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)約為其活性的 30倍。

帽蕊木;α-葡萄糖苷酶;抑制活性

帽蕊木 (M itragyna rotundifoliaKuntze.)為茜草科帽蕊木屬植物。本屬植物約有 10種,非洲分布 4種,亞洲 6種,分布在印度,孟加拉,緬甸,泰國和老撾等國家[1-3]。我國僅有 1種,產于云南南部[4,5]。該屬的植物民間用途廣泛,可用于發熱、疝氣、肌肉疼痛的治療[6,7],抗瘧[8],并可以驅蟲[9]。文獻研究表明,帽蕊木屬植物化學研究主要集中在吲哚類生物堿成分上[10,11],藥理研究也非常明確,主要集中在抗腫瘤、心血管疾病和抗菌活性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內α-葡萄糖苷酶的活性,延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收,從而有效降低餐后高血糖。由于其獨特的優勢,目前已被廣泛用于糖尿病及其并發癥的防治,臨床上主要使用阿卡波糖和伏格列波糖等。作者在對產于云南西雙版納的帽蕊木進行系列研究中[12-16],共得到 28個化合物。本文利用體外抑制α-葡萄糖苷酶模型,首次對帽蕊木提取物及其從中得到的 28個化合物進行α-葡萄糖苷酶活性篩選,發現莨菪內酯(scopletin)具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase,EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG,026K1516);阿卡波糖 (Acarbose,Lot 16869)和 DMSO均購自 Sigma公司;帽蕊木于 2006年 10月采集于云南西雙版納地區,經中國科學院西雙版納植物園崔景云高級工程師鑒定為茜草科帽蕊木屬植物帽蕊木M.rotundifoliaKuntze,標本存于河南大學天然藥物研究所 (No.0610221)。

1.2 儀器

MultiskanMK3酶標儀 (Ther mo Electron);LRH-150恒溫培養箱 (上海一恒科技有限公司);DELTA 320型 PH計 (Mettler-Toledo);電子天平 (Mettler-Toledo)。

2 方法

2.1 提取物制備

帽蕊木莖皮和葉干燥,粉碎后,分別用 V(丙酮)∶V(水)=7∶3室溫下冷浸 3次,每次 7 d。回收試劑后分別得到帽蕊木莖皮浸膏和葉浸膏。分別將浸膏懸浮于水中,依次向懸浮液中加入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇,振搖萃取。萃取液真空減壓干燥,分別得到帽蕊木皮和葉石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選方法

2.2.1 檢測方法

在 96孔板上進行,反應體系參照張麗建立[17]的方法,按照 I%=[1-(OD樣品-OD樣空)/(OD陰性-OD空白)]×100%計算抑制率,并用Origin軟件求出相應 IC50值。

2.2.2 標準曲線制作

根據采用的反應體系,用磷酸緩沖液 (pH 6.8)配置 1000μmol/L PNP,稀釋成 400、300、200、150、100、50、25、5和 0μmol/L。分別取 9種不同濃度的PNP溶液各160μL,加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL,混勻,在 405 nm下測定 OD值,測三組取平均值。以OD值為縱坐標,對硝基苯酚濃度為橫坐標,做出標準曲線。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶活力的測定

根據所采用的反應體系:112μL磷酸鉀緩沖液(pH 6.8),加入 20μL 0.2 U/mLα-糖苷酶,8μL DMSO,37℃恒溫 15 min后加入 2.5 mmol/L PNPG 20μL,37℃恒溫反應 15 min。再加入 80μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液,于 405 nm波長下測OD值。

酶活力單位定義:37℃、pH 6.8條件下,每分鐘水解底物所產生 1μmol對硝基苯酚的酶量,規定為一個酶活力單位 (U)[17]。

3 結果與討論

3.1 提取物活性的比較分析

表 1顯示,同一濃度下,帽蕊木不同溶劑提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性從大到小依次為:帽蕊木葉正丁醇提取物 ＞帽蕊木皮正丁醇提取物 ＞帽蕊木葉乙酸乙酯提取物 ＞帽蕊木皮乙酸乙酯提取物 ＞帽蕊木皮石油醚提取物 ＞Acarbose＞帽蕊木葉正丁醇提取物。而從帽蕊木皮中得到的化合物 Scopletin在濃度為 100μg/mL時,對α-葡萄糖糖苷酶的抑制率已達到 81.59%。

由以上初篩抑制率為指導,對帽蕊木提取物進行復篩,發現:帽蕊木提取物中,葉抑制α-葡萄糖糖苷酶活性最高,乙酸乙酯和正丁醇提取物的 I C50值分別為 34.46μg/mL和 6.023μg/mL,遠遠高于陽性對照 acarbose(IC50=1081.27μg/mL);帽蕊木皮也具有很高的抑制α-葡萄糖糖苷酶活性,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物 (IC50值分別為 260.98、68.82、18.69μg/mL)都高于陽性對照 acarbose。

由此可見帽蕊木不同部位雖都具有很高的α-葡萄糖糖苷酶抑制活性,但抑制活性有所差別,葉的活性要好于皮。

另外,帽蕊木同一部位不同溶劑提取物相比較,乙酸乙酯和正丁醇提取物的活性高于石油醚提取物。說明帽蕊木的α-葡萄糖苷酶抑制活性不僅與部位有關,還與提取物極性密切相關。從帽蕊木中得到的化合物 scopletin具有很強的抑制α-葡萄糖苷酶活性 (I C50=35.03μg/mL),其對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度比陽性對照 acarbose約小 30倍。

表 1 不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 1 The inhibitory activity of extracts ofα-glucosidase

3.2 樣品濃度對α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的影響

圖 1顯示,在試驗濃度范圍內,帽蕊木不同部位不同溶劑提取物及從中分離得到的化合物 scopletin的α-葡萄糖苷酶抑制活性均呈劑量依賴性,而且,當抑制率達到一定程度時,再增加提取物質量濃度,抑制活性不再提高。

圖 1 樣品濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 Effect of sample concentration on the activity ofαglucosidase

3.3 化合物 scopletin抑制類型的確定

化合物 scopletin取合適的兩個不同濃度,PNPG取 5個不同濃度,分別測定反應速度。按 Lineweave-Burk作圖法,以 1/[S]為橫坐標 1/V為縱坐標,分別繪制化合物的抑制作用動力學曲線 (圖 2),得到α-葡萄糖糖苷酶的Km值為 2.89 mmol/L。

圖中可以看出,化合物 scopletin對α-葡萄糖苷酶抑制作用屬非競爭性抑制,反應速度Vmax隨著受試化合物濃度的增大而變小,米氏常數Km保持不變。根據非競爭性抑制動力學方程[18,19]:1/V′max= 1/Vmax(1+[I]/Ki),可以求出化合物 Scopletin的Ki值分別為:2.44μg/mL。

圖 2 化合物 scopletin的 Lineweave-Burk雙倒數曲線Fig.2 The Lineweave-Burk of scopletin on the activity of α-glucosidase

4 結論

4.1 本文首次利用體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選模型對帽蕊木不同部位不同溶劑提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了考察,結果表明帽蕊木葉和皮都具有很好的活性,且葉的活性好于皮。

4.2 化合物 scopletin具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性 (I C50=35.03μg/mL),其對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度比陽性對照 acarbose約小 30倍,以期開發為天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

4.3 化合物 scopletin對α-葡萄糖苷酶抑制作用屬于非競爭性抑制類型,說明它既可以和酶,也可以和酶-底物復合物結合,從而降低酶活性,達到降低血糖作用。

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Inhibition ofα-Glucoside ofM itragyna rotundifoliaKuntze.

KANGWen-yi＊,SONG Yan-li,ZHANGLi
Institute of ChineseM ateria M edica,Henan University,Kaifeng 475004,China

The inhibitory activities ofα-glucosidase of leaves,barks extracts and compounds fromM itragyna rotundifoliaKuntze.were screenedin vitrofor the first t ime,and the results were compared with acarbose.The results showed that leaves and barks extracts fromM.rotundifoliaall had inhibitory activity ofα-glucosidase,and the activity of leaveswas higher than thatof barks.Then-butanol extract and ethyl acetate extract from the same partofM.rotundifoliahad higher inhibitory activity ofα-glucosidase than thatof the petroleum ether extract.The compound of scopletin had higher inhibitory activity ofα-glucosidase(I C50=35.03μg/mL),and the value of I C50was lowered about thirty times than that of positive control acarbose.

M itragyna rotundifoliaKuntze.;α-glucosidase;inhibitory activity

Q946.81;R285

A

1001-6880(2010)04-0658-04

2008-09-04 接受日期:2008-10-23

河南省教育廳基礎研究計劃(2008A360002)

＊通訊作者 Tel:86-378-3880680;E-mail:kangweny@hotmail.com