一種具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的實驗研究

肖友元,何宇新,李 玲,謝 雷

1四川省人民醫院,成都 610072;2西華大學生物工程學院,成都 610039;3成都自豪藥業有限公司,成都 610041

一種具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的實驗研究

肖友元1,何宇新2＊,李 玲2,謝 雷3

1四川省人民醫院,成都 610072;2西華大學生物工程學院,成都 610039;3成都自豪藥業有限公司,成都 610041

為了研究特種脂肪酶 ZFM對大鼠非酒精單純性脂肪肝 NAFLD的防治作用,本次實驗通過給大鼠NAFLD模型灌胃 ZFM,然后進行常規觀察、體重及肝臟器系數測定、血清中ALT和AST的含量動態測定、肝臟肉眼大體外觀變化情況觀察、肝組織內 TG的含量測定、肝組織病理學分析等。結果表明,ZFM顯著降低ALT活性及肝組織 TG含量,同時也可減輕肝脂肪變性的程度,說明 ZFM具有顯著的抗大鼠NAFLD的作用。

特種脂肪酶;非酒精性脂肪肝;甘油三酯;谷丙轉氨酶;谷草轉氨酶

非酒精單純性脂肪肝 (Non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)是由于各種肝內外因素所致的肝臟脂肪代謝功能障礙,導致肝細胞內脂類物質 (主要為三酰甘油)蓄積過多和變性的病理綜合征,包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化[1]。當肝細胞受到損傷時,谷丙轉氨酶 (Alanine aminotransferase,ALT)釋放到血液中,血清中 ALT的活力隨之升高,1%的肝臟受損,可以使血清中ALT的濃度增加 1倍。正常情況下,血清中的谷草轉氨酶 (Aspartate aminotransferase,AST)的活力不高,但當組織細胞,特別是肝臟和心臟等器官的細胞發生病變時,會導致血清中 AST的活力明顯升高[2]。所以,ALT和AST可以比較敏感地監測到肝臟是否受到損害。本試驗通過高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精單純性脂肪肝模型,考查特種脂肪酶(ZFM)對大鼠NAFLD的防治作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

SD大鼠,體重 230～250 g,雌雄各半(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供),合格證號SCXK(京)2007-0001;特種脂肪酶(ZFM)受試藥(由成都自豪藥業有限公司提供,批號:081223),實驗時先用適量吐溫研磨,再用 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設計濃度配制;易善復 (多烯磷脂酰膽堿膠囊)(塞諾菲安萬特 (北京)制藥有限公司,批號:D8139),實驗時先用適量吐溫研磨,再用 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設計濃度配制。

1.2 試劑

膽固醇 (成都科龍化工試劑廠,批號: 20071229);吐溫-80(成都科龍化工試劑廠,批號: 20050402);膽酸鈉 (上海 Solarbio,批號:20060826);丙硫氧嘧啶片(上海復星朝暉藥業有限公司,批號: 071105);1,2丙二醇 (天津市大茂化學試劑廠,批號:20051128);羧甲基纖維素鈉 (上海三浦化工有限公司,批號:20010911)。

1.3 儀器

LD2-5醫用離心機(北京醫用離心機廠);SHAC恒溫振蕩器(常州國化電器有限公司);T MS-1024i全自動生化分析儀 (日本國東京醫療公司);BP221型電子天平(SARTOR IOU)。

1.4 實驗分組與方法

取 SD大鼠,體重 230～250 g,64只,雌雄各半,隨機分為 4組,每組動物 16只。將大鼠適應性飼養3 d后,每天上午各組大鼠分別按表 1設計劑量給藥,空白組給予相應的 CMC混懸液;下午除空白組外,其余各組大鼠分別灌胃給予高脂乳液 (20%豬油、8%膽固醇、1.2%膽酸鈉和 0.6%丙硫氧嘧啶) lmL/l00 g。于第 4周后末次給藥后禁食 16 h(不禁水),眼眶取血,離心并分離血清,動態測定給藥 4周后的血清生化指標。

于第 6周后末次給藥后禁食 16 h(不禁水),稱取大鼠體重,股動脈取血,離心并分離血清,-30℃低溫保存,待測血清中的生化指標;另摘取肝臟并稱重,觀察大體外觀后,每只大鼠在相同部位切下 2 g肝組織置于預冷的生理鹽水中制成 1O%肝勻漿,4℃靜置 48 h后,10000 r/min,離心 20 min,取上清液,用全自動生化儀測定肝組織內甘油三酯 (Triglyceride,TG)的含量;另取肝左葉 1塊放于 10%中性福爾馬林溶液,待作肝組織病理學檢查 (固定后,石蠟包埋,切片作 HE染色)。

1.5 統計方法

用 SPSS11.5統計軟件進行統計分析。以(x±s)表示結果的數據,用單因數方差分析進行組間比較,肝病理組間差異的顯著性檢驗運用非參數檢驗Ridit分析方法,顯著性水平為P＜0.05,及顯著水平為P＜0.01。

目前，B公司對經銷商的培訓嚴重不足，導致經銷商無法學習到業內優秀經驗，無法吸取行業內經驗教訓，無法獲取公司最新的經營理念和行業前沿信息，影響經銷商管理效果。

2 結果

2.1 常規觀察

實驗期間空白組動物活動、飲食正常、皮毛光亮整潔、體重持續增長,其余各組在灌胃給予高脂乳液兩周后逐漸出現不同程度的精神萎靡、活動減少、體重增加緩慢、無力、蜷縮、飲食減少、皮毛凌亂、萎黃等。

2.2 體重及肝臟器系數測定

結果提示,灌胃給予高脂乳液一定周期后,模型對照組體重增加緩慢,和空白對照組比較有顯著性差異(P＜0.01),ZFM劑量組和易善福組在給藥前4周均有抵抗大鼠體重增加緩慢的作用趨勢,但無統計學意義。

另脂肪肝模型大鼠的肝臟指數較空白組明顯升高(P＜0.01);ZFM劑量組和易善福組均有降低脂肪肝模型大鼠的肝臟器系數的作用趨勢,但無統計學意義。結果見表 2

表 2 ZFM對脂肪肝大鼠體重及肝臟器系數的影響(x±s)Table 2 The effects of the weight of fatty liver and coefficient by ZFM(x±s)

2.3 血清中ALT﹑AST的含量動態測定

血清中ALT﹑AST的含量動態測定結果見表3。

表 3 ZFM對大鼠脂肪肝血清中ALT﹑AST的含量的影響(x±s)Table 3 The effects ofALT﹑ AST in serum of the fatty liver by ZFM(x±s)

當急性肝炎和慢性肝炎和輕型,雖有肝細胞的損傷,肝細胞的線粒體仍保持完整,故釋放入血的只有存在于肝細胞漿內的 ALT,故 ALT升高明顯;重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型,肝細胞的線粒體也遭到了嚴重的破壞,AST從線粒體和胞漿內釋出, AST也明顯升高。結果提示,在給予高脂乳液 4周, 6周后,脂肪肝模型大鼠血清中ALT的活性明顯較空白組明顯升高 (＊＊P＜0.01);與模型對照組相比,ZFM劑量組及易善復組均能明顯降低模型大鼠ALT活性 (＊P＜0.05),表明 ZFM具有一定的降酶作用。

但脂肪肝模型大鼠血清中AST未明顯升高,原因可能為我們通過高脂乳液造成的非酒精性脂肪肝模型,該模型程度較輕,肝細胞的線粒體未遭到嚴重的破壞。

2.4 肝臟肉眼大體外觀變化情況

空白組肝臟肉眼觀察呈鮮紅色,邊緣銳利,表面光滑。脂肪肝模型對照組肉眼見肝臟體積增大,邊緣變鈍,顏色呈奶黃色,切面油膩狀,有明顯脂肪顆粒,提示病變基礎是肝細胞脂肪積聚;ZFM給藥組和易善復組肝臟肉眼觀察有部分肝臟呈鮮紅色。

2.5 肝組織內甘油三酯的含量結果見表 4

表 4 ZFM對脂肪肝大鼠肝組織內 TG的影響(x±s)Table 4 The effects of the TG in fatty liver by ZFM(x±s)

注:和模型組比較,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。

Tagging:Comparison to the model group,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01.

脂肪肝主要是 GT大量堆積于肝臟所致的一種病理改變,因此測定肝組織中 GT的含量尤為重要,結果提示,非酒精性脂肪肝大鼠肝細胞內 GT含量明顯升高,與空白組比較,差異有高度顯著性 (＊＊P＜0.01),ZF M劑量組及易善復組,均能顯著降低大鼠肝組織 GT的含量(＊P＜0.05),表明 ZF M具有一定的降低大鼠肝脂肪變性的作用。

2.6 肝組織病理學分析(HE染色,100×)

表 5 肝組織病理損傷判斷標準Table 5 The yardstick of pathological injury of liver

脂肪空泡融合為大空泡,將細胞核擠向胞膜下,狀似脂肪細胞。 重度損傷 +++ 3壞死Necrosis 表示沒有壞死, 無 0點狀壞死,肝小葉內可有散在的肝細胞壞死,每個壞死灶僅累及單個或幾個肝細胞。 輕度損傷 + 1碎小片狀壞死,肝細胞呈灶狀壞死,崩解 中度損傷 ++ 2有大片溶解灶性壞死。 重度損傷 +++ 3纖維化 沒有增生 無 0組織增生 Fibrosis tissue 僅有纖維細胞及少許纖維組織增生,正常肝小葉結構隱約可見。 輕度損傷 + 1有明顯的纖維組織增生,正常肝小葉結構不明顯,但尚未形成明顯假小葉。中度損傷 ++ 2有大量組織增生,將細胞圍成小塊呈小島狀,明顯假小葉形成。 重度損傷 +++ 3

表 6 肝病理分級結果(表中數為例數)Table 6 Pathological of liver and results(the number is examples)

表 7 ZFM對脂肪肝大鼠肝臟病理的影響Table 7 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

圖 1 ZFM對脂肪肝大鼠肝臟病理的影響Fig.1 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

由表 6、表 7、圖 1可知,模型組與空白對照組比較,出現了肝細胞的脂肪變性,經非參數檢驗,具有極顯著性差異 (＊＊P＜0.01),表明造模成功;與模型組比較,ZFM劑量組及易善復組均可顯著降低肝脂肪變性程度 (＊P＜0.05),表明 ZFM具有一定的降低脂肪肝大鼠脂肪變性的作用。

但從表 6可知,其中 ZFM劑量組肝壞死評定中,有一只大鼠肝臟病理評分為壞死 2分,經仔細核查,排除原發性可能,雖然動物實驗數據具有一定的動態波動,也屬正常,同時因供樣量太少,僅有一個劑量,但對于一個抗脂肪肝的新藥來說,以后的研究中,須嚴密考查該試驗藥長期給藥后,在減輕脂肪變性的同時,是否也會引起肝細胞的損傷。

3 結論

脂肪肝 (Fatty Liver)作為一種病理學概念,系指肝內脂肪含量超過肝濕重的 5%,或肝活檢 1/3以上肝細胞有脂肪變性且彌漫分布于全肝。其對應的臨床概念是脂肪性肝病 (Fatty Liver Disease,FLD),系指病變主體在肝小葉,以彌漫性肝細胞脂肪變(多為大泡性脂肪變)為病理特征的臨床綜合征。目前,按相關專業委員會的疾病診斷標準及有關共識可以明確的是:①脂肪性肝病在臨床上根據患者有無過量飲酒史,分酒精性脂肪性肝病 (酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝病;②酒精性肝病臨床診斷通常分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化;③非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分為單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎 (NASH)和肝硬化三種類型。

本次實驗研究旨在通過高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精單純性脂肪肝模型,考查該試驗藥對大鼠非酒精單純性脂肪肝的防治作用,實驗結果表明,模型對照組與空白對照組比較,肝臟器系數﹑ALT活性、肝組織甘油三酯含量均顯著升高,同時肝病理也顯示出現了一定的脂肪變性,按照專業委員會的診斷標準,該模型屬于非酒精單純性脂肪肝模型;ZFM劑量組和模型對照組比較,可顯著降低ALT活性及肝組織甘油三酯含量,同時也可減輕肝脂肪變性的程度。

綜上所述:通過微生物發酵得到的 ZFM試驗藥,具有顯著的抗非酒精單純性大鼠脂肪肝的作用,具有創新藥物開發前景。同時,對于一個抗脂肪肝的新藥來說,以后的研究再觀察對酒精性脂肪肝的作用做系統的研究,再嚴密考查該試驗藥長期給藥后,在減輕脂肪變性的同時,進一步探討其作用機理。

1 Guo LL(郭麗麗),Liu JC(劉近春).The observation of curative efects of polyene phosphatidyl choline in combination with compound salvial injection for nonalcoholic fatty liver disease.J ChangzhiM ed Coll(長治醫學院學報),2009,2: 117-119.

2 Zhou X(周新),Xu ZG(徐植光).ClinicalBiochemistry and Biochemistry Test(臨床生物化學與生物化學檢驗).Beijing:People's Health Publishing House,2003.238-239.

Anti-fatty L iver Effect of a kind of L ipase

XIAO You-yuan1,HE Yu-xin2＊,L ILing2,XIE Lei3

1The People’s Hospital of Sichuan Province,Chengdu 610072,China;2B io-Engineering College of Xihua University, Chengdu 610039,China;3Chengdu Zihao pha rm aceutical Co.,Ltd.Chengdu 610041,China

To research the preventive and therapeutic effects of ZFM for non-alcohol fatty liver disease(NAFLD),in this experimentwe used ZFM to gavage to the NAFLD model.Investigate the generalobservation,theweightof fatty liver and coefficient,dynamic measurement ofALT and AST,observe the gross appearance by naked eye,measure the TG,analyse the yardstick of pathologicalof liver.The results showed that,ZFM can extraordinary reduce the activity ofALT and TG, and ease liver degeneration.Thus it could be concluded ZFM has extraordinary activity forNAFLD.

ZFM;NAFLD;TG;ALT;AST

R575

A

1001-6880(2010)05-0781-05

2009-09-21 接受日期:2010-04-27

＊通訊作者 Tel:86-28-87725898;E-mail:heyuxin66@126.com