番荔枝內生真菌Hypoxylonsp.B38的代謝產物研究

林 筱,魯春華,黃耀堅,沈月毛

廈門大學生命科學學院藥物微生物工程實驗室,廈門 361005

番荔枝內生真菌Hypoxylonsp.B38的代謝產物研究

林 筱,魯春華,黃耀堅＊,沈月毛

廈門大學生命科學學院藥物微生物工程實驗室,廈門 361005

從番荔枝內生真菌Hypoxylonsp.B38的固體平板發酵提取物中分離到 5個化合物,通過NMR和MS等方法把它們分別被鑒定為Lachnellin D(1)、Dienetriol 9(2)、Lachnellin C(3)、Lachnellin B(4)和Benzo[d][1, 3]dioxol-5-ylmethanol(5)。

番荔枝;Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

植物內生真菌是尋找生物活性天然產物的豐富資源,目前已報道從內生真菌中得到的次生代謝產物包括抗生素、抗腫瘤化合物、抗氧化化合物等[1,2]。我們研究的內生真菌來自番荔枝科 (Annona)的番荔枝 (Annona squam osaL.)。從該植物中分離的番荔枝內酯類化合物多達 100多種,且幾乎都具有抗腫瘤活性,番荔枝科植物的抗腫瘤藥物開發已成為熱點。對番荔枝內生真菌進行研究,不僅可以考察番荔枝內生真菌的種群多樣性,同時番荔枝內生真菌是重要的微生物資源,對其次級代謝產物進行研究可以發現結構新穎的化合物;本文介紹從其內生真菌Hypoxylonsp.B38分離到的 5個已知化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

反相硅膠 RP-18(Merck);凝膠 Sephadex LH-20 (Phammacia);柱層析用硅膠 (200～300目)和硅膠GF254薄層層析板 (青島海洋化工廠);Bruke ARX600核磁共振儀;Micro Mass-Q TOF質譜儀。

1.2 實驗菌株和發酵培養基

實驗菌株從采自中國福建省廈門地區的番荔枝植物葉片組織中分離純化得到。B38通過 ITS序列分子鑒定,確定為Hypoxylonsp.,其 ITS r DNA序列信息已經公布(EF488415)。

馬鈴薯葡萄糖固體培養基 (PDA):馬鈴薯去皮,200 g切成小塊,加水煮沸 30 min,4～6層紗布過濾,加 20 g葡萄糖,加入 1.5%～2%的瓊脂,加水定容至 1000 mL。121℃高壓滅菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株Hypoxylonsp.B38的發酵

從 PDA培養基斜面上挑取Hypoxylonsp.B38菌體接種至 PDA平板,28℃培養 3～4 d后挑取菌體,接種至 4 L PDA培養基平板中,28℃培養 14 d。

1.3.2 成分的提取分離

培養物切割成小塊狀后用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 (80∶15∶5)的混合溶液提取,共 3次;合并 3次提取液后,40℃減壓濃縮至干,用甲醇溶解過濾得發酵提取浸膏。浸膏用水溶解,用乙酸乙酯萃取至無色,40℃減壓濃縮至干,得到乙酸乙酯可溶部分8.0 g。

乙酸乙酯可溶部分 8.0 g經反相中壓液相柱層析(RP-18,180 g),依次用 30%、50%、70%、100%甲醇水系統洗脫,每個梯度 2 L,流速為 20 mL/min,每 200 mL收集一管,分別濃縮至干。少量甲醇溶解后,根據 TLC檢測結果合并,得 A(1.0 g)、B(2.5 g)、C(1.6 g)、D(1.6 g)、E(1.4 g)五個組分。

A(1.0 g)用經凝膠柱 (Sephadex LH-20,140 g)層析分離,甲醇洗脫,經 TLC檢測,合并得 A-1 (800 mg)、A-2(80 mg)、A-3(40 mg)。A-1(800 mg),經反復的中壓反相柱層析,30%甲醇洗脫,得到A-1A 28 mg,A-1B 40 mg,A-1C 120 mg。A-1A經反相中壓液相柱層析,25%甲醇洗脫,TLC檢測合并8-11得化合物 2(2 mg)。A-1B用正相柱層析分離,0.5 g硅膠石油醚飽和裝柱,石油醚∶丙酮 (100∶1,80∶1)洗脫,約 5 mL/tube接收,合并 80∶1洗脫出的 42～70管,經薄層層析 (氯仿∶甲醇 =10∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.6左右處有紫紅色轉棕紅色的單點,記為化合物 1(14 mg)。A-1C用 2 g硅膠柱層析分離,石油醚飽和裝柱,石油醚∶丙酮 (500∶1,250∶1)洗脫,約 6 mL/tube接收,合并 500∶1洗脫的 55～61管,經薄層層析 (石油醚∶丙酮 =5∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.5左右處有紫紅色轉棕黃色的單點,記為化合物 3(12 mg);合并 250∶1洗脫的 104～133管,經薄層層析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.5左右處有紫紅色轉棕黃色的單點,記為化合物 4(13 mg)。

A-3組分 (40 mg)稱取 0.08 g普通硅膠拌樣, 0.8 g硅膠,石油醚裝柱,石油醚∶丙酮 (200∶1,100∶1)洗脫,約 6 mL/tube接收,合并 100∶1洗脫的 17～26管,經薄層層析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值約 0.4左右處有紫黑色的單點,記為化合物 5(3 mg)。

2 結構鑒定

通過中壓反相,正相以及凝膠柱層析,共分離到5個化合物,根據NMR以及MS數據鑒定了化合物1～5(圖 1),它們分別為Lachnellin D(1),Dienetriol 9(2),Lachnellin C (3),Lachnellin B (4)和Benzo[d]1,3]dioxol-5-y lmethanol(5)。

圖 1 化合物 1～5的結構式Fig.1 Structures of compounds 1-5

2.6 化合物 1～5的生物活性

采用MTT法[5]測定化合物 1～5的抗腫瘤活性,指示細胞株為 Hep G2和 HeLa,化合物 1～5在測定濃度為 10μg/mL時沒有顯示出對腫瘤細胞株Hep G2和 HeLa的活性;采用濾紙片法[6]測定化合物 1～5對指示菌Bacillus subtilisCMCC63501,EscherichiacoliCMCC44103,StaphylococcusaureusATCC9763,Candida albicansAS2.538的活性,結果顯示,在每片濾紙片含有 50μg樣品時也沒有顯示出對指示菌株的抑制活性。

1 Tan RX,Zou WX.Endophytes:a rich source of functional metabolites.Nat Prod Reports,2001,18:448-459.

2 Sean FB,Shana MB,Jon C.The Guanacastepenes:a highly diverse family of secondarymetabolites produced by an endophytic fungus.J Am er Chem Soc,2001,123:9900-9901.

3 SemarM,Anke H,ArendholzWR,et al.Lachnellins A,B, C,D,and naphthalene-1,3,8-triol,biologically active compounds from a Lachnellula species(Ascomycetes).Zeitschrift fuerNaturforschung,C:B iosciences,1996,51:500-512.

4 Fuchser J,Zeeck A.Secondary metabolites by chemical screening.Part 34.Aspinolides and aspinonene/aspyrone cometabolites,new pentaketides produced byAspergillus ochraceus.Liebigs Annalen/Recueil,1997,1:87-95.

5 Solis PN,W right CW,AndersonMM,et al.A microwell cytotoxicity assay usingA rtem ia salina(Brine Shrimp).Planta M ed,1993,59:250-252.

6 Kronvall G,Ringertz S.Antibiotic disk diffusion testing revisited.single strain regression analysis.Review article.APM IS, 1991,99:295-306.

Five Compounds fromHypoxylonsp.B38, an Endophytic Fungal Stra in ofAnnona squam osaL.

L IN Xiao,LU Chun-hua,HUANG Yao-jian＊,SHEN Yue-mao
Fujian Engineering Laboratory of Phar maceuticals,School of Life Sciences, Xiam en University,Xiam en 361005,China

Five compounds were isolated from the extract of fermentation broth of endophytic fungus(Hypoxylonsp. B38)ofAnnona squam osaL.On the basis ofNMR andMS data,compounds 1-5 were identified as lachnellinD(1),dienetriol 9(2),lachnellin C(3),lachnellin B(4)and benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethanol(5).

Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

R915;Q939.9

A

1001-6880(2010)05-0791-03

2008-12-09 接受日期:2009-02-12

教育部重大項目 (306010)

＊通訊作者 Tel:86-592-2184892;E-mail:yjh@xmu.edu.cn