傳統(tǒng)中藏藥材小秦艽中 20種氨基酸的測(cè)定

孫 菁,李法強(qiáng),徐文華,陳桂琛＊

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院青海鹽湖研究所,西寧 810008

傳統(tǒng)中藏藥材小秦艽中 20種氨基酸的測(cè)定

孫 菁1,李法強(qiáng)2,徐文華1,陳桂琛1＊

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院青海鹽湖研究所,西寧 810008

以 1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)作為柱前衍生化試劑,采用梯度洗脫實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)中藏藥材小秦艽中 20種氨基酸衍生物的基線(xiàn)分離,利用電噴霧離子源 (ESI Source)正離子模式,實(shí)現(xiàn)了小秦艽中氨基酸的定性測(cè)定,可為秦艽類(lèi)藥用植物資源化學(xué)成分的深入開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。結(jié)果表明,所建立的方法線(xiàn)性范圍寬、重復(fù)性較好,大多數(shù)氨基酸衍生物的線(xiàn)性回歸系數(shù)大于 0.9990,檢測(cè)限為 6.5～178.2 fmol。小秦艽中氨基酸組成豐富,至少含有 18種氨基酸和 7種人體必需氨基酸,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。同一氨基酸成分在不同采樣點(diǎn)表現(xiàn)出不同含量,體現(xiàn)了小秦艽該類(lèi)成分的地理分布差異特征。氨基酸成分與生態(tài)環(huán)境的相關(guān)分析結(jié)果顯示只有緯度與Lys之間達(dá)到了極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,其余各因子之間均未達(dá)到顯著水平,說(shuō)明緯度對(duì)小秦艽氨基酸含量有較大的影響。

小秦艽;BCEOC;氨基酸;生態(tài)環(huán)境

小秦艽 (Gentiana dahuricaFischer)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬多年生草本,是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藏藥材,收載于 2005版《中國(guó)藥典》[1]和藏藥志中[2]。其生于海拔 800～4500 m的草原陽(yáng)坡、河谷階地等生境下,在我國(guó)主要分布于四川北部及西北部、西北、華北、東北等地區(qū)[3];以干燥根入藥,可用于治療扁桃體炎、蕁麻疹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[1,2]。目前,對(duì)小秦艽的研究主要集中在其 rRNA序列的分析[4]、龍膽苦苷含量的測(cè)定[5]以及化學(xué)成分的分析上[6],有關(guān)其氨基酸含量的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。氨基酸是廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)的有機(jī)氮化合物,是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)的重要組成,在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理生化作用[7,8],同時(shí)也是許多中藥藥用價(jià)值的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一[9-11]。因此,本文采用新型高靈敏度熒光試劑 1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)[12]作為柱前衍生化試劑,室溫下在乙腈溶劑中以硼酸鈉緩沖溶液控制反應(yīng)體系的 pH=9.0,10 min即可衍生完全。衍生物穩(wěn)定性好,衍生產(chǎn)率高,衍生溶液不必預(yù)處理可直接進(jìn)樣分析。在乙腈/水作流動(dòng)相的條件下,采用梯度洗脫達(dá)到了 20種氨基酸衍生物的完全基線(xiàn)分離,實(shí)現(xiàn)了小秦艽根部氨基酸的快速、準(zhǔn)確分析,可為秦艽類(lèi)藥用植物的治病機(jī)理、合理用藥以及深入開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小秦艽根部采自青海省 8個(gè)不同地方 (表 1),以 GPS記錄海拔和經(jīng)緯度。采集后,混勻去除雜土等,自然狀態(tài)下風(fēng)干,粉碎,過(guò) 100目篩,待分析用。

表 1 采樣點(diǎn)生態(tài)環(huán)境調(diào)查數(shù)據(jù)Table 1 Ecological environmental data of sampling localities

1.2 儀器與試劑

Agilent1100型高效液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司)配備四元梯度泵,在線(xiàn)真空脫氣機(jī),熒光檢測(cè)器 (Fluorescence Detector),100位自動(dòng)進(jìn)樣器,電噴霧電離源 (Electrospray Ionization Source, ESI Source),HypersilBDS C18色譜柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,大連依立特公司)。BCEOC由山東曲阜師范大學(xué)尤進(jìn)茂教授實(shí)驗(yàn)室合成,氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品 (Sigma公司),色譜純乙腈(禹城化學(xué)試劑廠(chǎng)),其它試劑均為分析純,純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

圖1 BCEOC與氨基酸衍生反應(yīng)概況Fig.1 Derivatization scheme ofBCEOC with amino acids

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取定量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入少量 6 mol/L的鹽酸溶解后用 6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至中性,然后用 pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液定容配成1.0×10-2mol/L的溶液,相應(yīng)低濃度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(5.0×10-4mol/L)以色譜純乙腈稀釋而成。稱(chēng)取32.6 mgBCEOC,用無(wú)水乙腈溶解并定容至 10 mL,其濃度為 1.0×10-2mol/L。低濃度的衍生試劑 (1.0 ×10-3mol/L)用無(wú)水乙腈稀釋而成。

1.4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的衍生過(guò)程

向 1.5 mL安培瓶中依次加入 160μL乙腈,300 μL硼酸鈉緩沖溶液 (pH=9.0),15μL混合氨基酸,60μL衍生試劑溶液,于 30℃至 40℃水浴中反應(yīng) 10 min,加入 10μL 30%的乙酸溶液調(diào)至弱酸性后即可直接進(jìn)樣分析。衍生反應(yīng)概況如圖 1。

1.5 樣品的制備

參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行:稱(chēng)取約 100 mg粉碎后的樣品,置于 1.5 mL安培瓶中,加入 6 mol/L鹽酸溶液 1mL,密封后在 110℃水解 24 h,過(guò)濾,用N2吹干后用 1 mL pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液溶解,定容到 10 mL容量瓶中,相應(yīng)濃度為 1000 ng/μL。低濃度的水解溶液(10 ng/μL)用 pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液稀釋而成。

1.6 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱:HypersilBDS C18色譜柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,)。流動(dòng)相 A:30%乙腈水溶液 (含有 30 mmol/L的甲酸,用氨水調(diào)至 pH=3.7),B: 50%的乙腈,C:95%的乙腈。流速為 1.0 mL/min,進(jìn)樣量為 10μL,柱溫 30℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為:λex=333 nm,λem =390 nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表 2。

電噴霧離子源 (ESI Source)正離子模式 (positive ion mode),噴霧壓力為 241.32 kPa,干燥氣流量為 9 L/min,干燥氣溫度 350℃,毛細(xì)管電壓3500V[14,15]。

表 2 梯度洗脫程序Table 2 Chromatographic gradient conditions eluted on HypersilBDS C18column

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離及質(zhì)譜鑒定

按照標(biāo)準(zhǔn)品的衍生過(guò)程進(jìn)行衍生后,在 HypersilBDS C18色譜柱上以乙腈/水作流動(dòng)相,采用梯度洗脫在 65 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了 20種氨基酸衍生物的完全分離,結(jié)果見(jiàn)圖 2,所有衍生物均可獲得較好的基線(xiàn)分離。各分析組分的定性采用電噴霧電離源(ESI Source)進(jìn)行在線(xiàn)的柱后質(zhì)譜鑒定,質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表 3。

2.2 線(xiàn)性回歸方程、檢測(cè)限及回收率

不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣 10 μL,標(biāo)品的進(jìn)樣量在 105.6 pmol～51.6 fmol范圍內(nèi),依據(jù)各氨基酸衍生物的峰面積和進(jìn)樣量進(jìn)行線(xiàn)性回歸,所得回歸方程﹑相關(guān)系數(shù)和各種氨基酸衍生物檢測(cè)限見(jiàn)表 3。各氨基酸衍生物的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均在 0.9990以上,檢測(cè)限在 6.5～178.2 fmol之間 (按 S/n=3:1計(jì)算)。在制備得到的小秦艽根部水解氨基酸樣品中加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品后,按照上述衍生化條件和色譜分離條件進(jìn)行分析測(cè)定,所得 20種氨基酸衍生物的回收率均大于 93%。在相同洗脫條件下,對(duì) 53 pmol氨基酸衍生物進(jìn)行六次平行測(cè)定,保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD小于0.05%,峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD小于 2.3%,各種氨基酸衍生物保留時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性見(jiàn)表 3。

2.3 樣品的色譜分離和含量測(cè)定

按照 1.6項(xiàng)下色譜分離條件,對(duì)制備后的樣品分析其水解氨基酸,色譜分離圖見(jiàn)圖 3,含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 4。

圖 2 20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of twenty amino acid standards derivatized with BCEOC

表 3 20種氨基酸衍生物的線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)指標(biāo)(n=6)Table 3 Linear regression equations,and correlation index of 20 amino acid derivatives(n=6)

圖 3 小秦艽樣品中水解氨基酸代表性色譜分離圖Fig.3 Chromatographic separation of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricasamples

2.4 氨基酸類(lèi)成分與生態(tài)環(huán)境的相關(guān)分析

利用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中的相關(guān)分析方法對(duì)小秦艽中氨基酸類(lèi)成分與生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性進(jìn)行分析(表 5),結(jié)果表明只有緯度與 Lys之間達(dá)到了極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系 (P＜0.01),即緯度越高,Lys的含量越低;其余各因子之間均未達(dá)到顯著水平。

3 討論

表 4 小秦艽根部水解氨基酸含量(mg/g,n=3)Table 4 Contents of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricaroots(mg/g,n=3)

BCEOC試劑對(duì)氨基酸的測(cè)定具有較高的靈敏度[12],此方法能夠準(zhǔn)確定量且具有線(xiàn)性范圍寬、重

注:“-”表示未檢出。下同。Note:“-”refers to undetected.

表 5 小秦艽氨基酸與生態(tài)環(huán)境相關(guān)分析Table 5 Correlation coefficient matrix between amino acids inG.dahuricaand ecological environments

注:0.01水平時(shí)相關(guān)系顯著。Note:＊＊Correlation coefficient is significant at the level of 0.01(2-tailed).

現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),在氨基酸的分析研究中具有重要的作用。應(yīng)用于小秦艽氨基酸含量的測(cè)定,取得了較好的效果。

在所測(cè)定的 20種氨基酸中,小秦艽藥用部位富含 18種氨基酸,氨基酸種類(lèi)較豐富,其含量測(cè)定結(jié)果與另一藏藥波棱瓜的結(jié)果近似[11],其中包括 7種人體必需的氨基酸 (Thr,Val,Ile,Leu,Phe,Try, Lys),占氨基酸總量的 24.78%,有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。必需氨基酸的缺乏可減低體液的免疫反應(yīng),如Try能夠維持正常的抗體生成,Phe缺乏使抗體不能發(fā)生正常的反應(yīng)。必需氨基酸的缺乏,還可引起抗體合成的障礙。因此,氨基酸既可作為營(yíng)養(yǎng)成分,提供或補(bǔ)充生命體的生命活動(dòng)所需,又可用來(lái)防治多種疾病。其中Arg,Asp和 Glu對(duì)于治療肝膽類(lèi)疾病有直接的作用效果[16],小秦艽中 Asp平均含量較高(3.333 mg/g),其具有的藥理生物活性是否與上述氨基酸組成和含量有關(guān)尚需進(jìn)一步藥理研究證明。

由表 4可以看出,同一氨基酸成分在不同采樣點(diǎn)含量不同,以含量較高的Asp為例,其最高含量達(dá)到 10.377 mg/g,最低含量則為 0.806 mg/g,相差 12倍之多。顯示出小秦艽氨基酸類(lèi)成分的地理分布差異特征。氨基酸類(lèi)成分與環(huán)境因子的相關(guān)分析結(jié)果顯示,緯度越高,即越往北的地方,小秦艽中 Lys含量越低。可見(jiàn),緯度是影響小秦艽中氨基酸含量的首要因子。同時(shí)也表明,環(huán)境是決定藥用植物化學(xué)成分的一個(gè)重要因素[17]。

致謝:本研究中衍生試劑 BCEOC由山東曲阜師范大學(xué)尤進(jìn)茂教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到了趙先恩等同學(xué)的熱誠(chéng)幫助,在此一并表示感謝。

1 Pharmacopoeia of P.R.China,Vol.1(中華人民共和國(guó)藥典(一部)).Beijing:Chemical Industry Press,2005.210.

2 Yang YC(楊永昌).Tibetan Medicines(藏藥志).Xining: Xining People’s Press,1991.11.

3 Ho TN,Liu S W.A worldwide monograph of Gentiana.Beijing:Science Press,2001.174-175.

4 Ji KP(姬可平),Zhang XL(張西玲),Liu LS(劉麗莎),et al.Primary study on measuring the internal transcribed spacer I regions of rRNA genein seeds ofGentiana dahurica.China J Chin M atM ed(中國(guó)中藥雜志),2003,28:313-316.

5 Ni H(倪慧),MakhabelB(波拉提·馬卡比力),Qing DG (卿德剛),et al.Determination and comparison of gentiopicroside of various parts of five species of genus Gentiana collected from Xinjiang by TLCS.J Chin M ed M at(中藥材), 2004,27:500-501.

6 Yang J(楊婕),Ma J(馬驥),Zhou DX(周東星),et al. Study on the chemical constituents ofGentiana dahurica.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥),2006,37:187-189.

7 Aslam M,Travis RL,Rains DW.Differential effect of amino acids on nitrate uptake and reduction systems in barley roots.Plant Sci,2001,160:219-228.

8 Li XZ,Larson DE,Glibetic M,et al.Effect of glutamine on the induction of nitrate reductase.Physiol Plantarum,1995, 93:740-744.

9 WangDG(王德貴),Yao HY(姚惠英),Su Z W(蘇中武).Analyses on the amino acids and trace elements of 3 species of Prunella.J Plant Resources and Environ(植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)),1994,3(4):61-62.

10 Hong YL(洪燕龍),Du SY(杜守穎),Yang G(楊剛),et al.瓜蔞皮藥材及其注射液中總氨基酸的含量測(cè)定方法研究.Chin J Experim TraditM ed For m ulae(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志),2004,10(3):10-12.

11 Li YL(李玉林),Zhou CF(周昌范),Wang HL(王洪倫),et al.Analysis of amino acids in TibetanMedicine Herpetospermum penduculosum.Am ino Acids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),2005,27(4):11-12.

12 You JM,Ming YF,Shi Y W,et al.Development of a sensitive fluorescence derivatization reagent 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chloroformate(BCEOC)and its application for deter mination of amino acids from seeds and bryophyte plants using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection and identification with electrospray ionization mass spectrometry.Talanta,2005,68:448-458.

13 WeissM,MannebergM,Juranville JF,et al.Effect of the hydrolysismethod on the determination of the amino acid composition of proteins.J Chrom atogrA,1998,795:263-275.

14 Ndjoko K,Wolfender JL,Hostettmann K,et al.Determination of trace amounts of ginkgolic acids in Ginkgo biloba L.leaf extracts and phytophar maceuticals by liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry.J Chrom atogr B,2000,744: 249-255.

15 Friso S,Choi S W,Dolnikowski GG,et al.A method to assess genomic DNA methylation using high-perfor manceliquid chromatography/electrospray ionizationmass spectrometry.A-nal Chem,2002,74:4526-4531.

16 Yu CL(余傳隆).氨基酸與人類(lèi)健康.Am inoAcids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),1999,21(4):4-8.

17 Tao SH(陶曙紅),Wu FE(吳鳳鍔).Effect of ecological environment on active constituents of medicinal plants.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)),2003,15:174-177.

Determ ination of 20 Hydrolytic Am ino Acids in an Important Tibetan and Chinese M edicineGentiana dahurica

SUN Jing1,L I Fa-qiang2,XU Wen-hua1,CHEN Gui-chen1＊

1Q inghai Key Laboratory of Q inghai-Tibet Plateau B iological Resources,Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academ y of Sciences,Xining 810001,China;2Q inghai Institute of Salt Lakes,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China

A s imple and sensitive method for the determination of 20 amino acids in an important Chinese and Tibetan medicineGentiana dahuricausing pre-column derivatization-reversed phase HPLC with fluorescence detection and mass spectrometric identification was developed.1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chlorofor mate(BCEOC)was used as the fluorescence derivatization reagent.20 amino acid derivativeswere separated on a HypersilBDS C18columnwith a good baseline resolution and detected with the fluorescence of which excitation and emission wavelengths of derivatives were set at 333 and 390 nm,respectively.Experimental results indicated that the established method had good repeatability and the correlation coefficients for the amino acids derivatization were＞0.9990.The detection limit range(at single-to-noise of 3:1)was 6.5-178.2 fmol.The identification of amino acid derivatives from hydrolyzedG.dahuricawas obtained on the basis of ESI detection atpositivemode.The composition of amino acids inG.dahuricawas abundant and showed higher nutritional value,ofwhich there were 18 amino acids and 7 necessary amino acids for the health of people.The same amino acid had different concentration level in different sampling locality and presented the characteristics of geographical differentiation.Correlation coefficient matrix be tween amino acids and ecological environments showed that there was no significance among the rest factors except that latitude had a significant negative correlation relationship with Lys at the level of 0.01.Thus,at the present study,the ecological environment,especially the latitude, was one of the important factors influencing the chemical constituents of herbalmedicines.The established method could be used and provided reference for the further development and utilization ofGentianaspecies.

Gentiana dahuricaFischer;BCEOC;amino acids;ecological environments

R917;R927.2;Q948.11

A

1001-6880(2010)05-0840-06

2008-12-02 接受日期:2009-03-30

國(guó)家中西部專(zhuān)項(xiàng)(2001BA901A47)項(xiàng)目

＊通訊作者 Tel:86-971-6143900;E-mail:gcchen@nwipb.ac.cn