八種桑黃粗多糖化學組成與體外免疫活性的比較

王欽博,楊 焱,周 帥,劉艷芳,張勁松,唐慶九,馮 娜,吳 迪

1上海師范大學生命與環境科學學院,上海 200234;2農業部應用真菌資源與利用重點開放實驗室上海市食用菌工程技術研究中心上海市農業科學院食用菌研究所,上海 201106

八種桑黃粗多糖化學組成與體外免疫活性的比較

王欽博1.2,楊 焱2＊,周 帥2,劉艷芳2,張勁松2,唐慶九2,馮 娜2,吳 迪2

1上海師范大學生命與環境科學學院,上海 200234;2農業部應用真菌資源與利用重點開放實驗室上海市食用菌工程技術研究中心上海市農業科學院食用菌研究所,上海 201106

采用水提醇沉法提取了八種不同桑黃子實體的粗多糖,對八種桑黃粗多糖進行了多糖和蛋白質含量的測定,并進行了單糖組成和氨基酸成分的分析,同時對八種桑黃粗多糖進行了體外淋巴細胞增殖實驗。結果表明,八種桑黃粗多糖提取物中多糖和蛋白質的含量有較大差異,單糖組成、氨基酸種類及含量上也有一定的差異。體外對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的測定結果顯示,八種桑黃粗多糖均表現了一定的活性,其中 PB-10和JSH在樣品濃度 50μg/mL時就有較好的活性,同時 PB-10P和 JSHP的多糖和蛋白質含量也較其它品種高。研究結果在一定程度上說明桑黃粗多糖的免疫活性與多糖和蛋白質的含量和組成有著密切的關系。

桑黃多糖;單糖組成;氨基酸組成;體外免疫活性

桑黃 (Phellinussp.),俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等,是一種大型珍稀藥用真菌[1],屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬,味甘辛、性平、微苦[2]。現代研究表明,桑黃具有抗腫瘤[3]、抗氧化、抗肝纖維化[4]、增強免疫等功效[5]。目前,日本、韓國已有桑黃多糖產品用于癌癥治療,國際市場上價格昂貴,供不應求。與其它藥用真菌一樣,桑黃水提物的主要活性成分為多糖,它是一種能增強人體免疫功能的生物活性物質[6]。真菌多糖作為一種免疫型藥物用于臨床是近年來治療腫瘤的一個新方向,被稱為生物效應調節劑(BRM),它以多種功能參與機體的代謝調節活動,因而近年來越來越受到人們的重視[7]。桑黃的品種有很多,對不同菌種栽培得到的子實體成分和活性差異的研究目前還尚無報道。本文以不同菌種栽培得到的八種桑黃子實體為研究對象,對其多糖含量和單糖組成、蛋白質含量和氨基酸組成及體外細胞活性等方面進行了分析比較,旨在為進一步開發和利用桑黃選取合適的原料奠定基礎。

1 儀器與材料

Synergy HT多功能酶標儀 (B IO-TEK公司); SA-1480-2型超凈無菌工作臺 (上海上凈凈化設備有限公司);ICS2500離子色譜儀 (Dionex公司),電熱恒溫水浴鍋(上海益恒試驗儀器有限公司)。

植物凝集素 (PHA,Sigma公司)、胎牛血清(G IBCO公司);Alamar Blue(Biosource公司);三氟乙酸 (CF3COOH,TFA,Merck公司);95%乙醇、甲醇、鹽酸、濃硫酸均為 AR。單糖標準品:巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖(Sigma公司)。氨基酸標準品:精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸 (Roche公司)。

八個不同種類的桑黃子實體由上海市農科院食用菌研究所栽培所得。分別命名為 PB-10、PI-12、NFSH、MYSH、CSH、JSH、KSH、PLSH。菌種保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心,標本存放于上海市農科院食用菌研究所藥用真菌研究室。

2 實驗方法

2.1 桑黃水溶性子實體粗多糖的制備

取干燥的桑黃子實體粉碎物 10 g,加入 10～15倍的蒸餾水,沸水提取2 h,殘渣再提取一次;合并兩次提取液,濃縮 4000 r/min離心 10 min,去除沉淀;濃縮液再加上 95%的乙醇至終濃度為 60%,室溫下靜置 24 h,倒出上清液部分,離心收集沉淀,沉淀部分再加水熱溶解,離心除去不溶物質,溶液進行透析,透析后溶液進行冷凍干燥,得桑黃水溶性粗多糖。按該步驟分別制得八種桑黃水溶性粗多糖,分別命名為 PB-10P、PI-12P、NFSHP、MYSHP、CSHP、JSHP、KSHP、PLSHP。

2.2 水溶性粗多糖中多糖含量的測定

標準曲線的測定:取 18支試管,分別編號 1～6,設 3個重復,分別向各管加入葡萄糖標準液 (0.1 mg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,并分別在每管中加蒸餾水至 1 mL,然后加 5%的苯酚 0.5 mL和2.5 mL濃硫酸,振蕩混勻,沸水浴15 min后,迅速在冰水中冷卻,之后在 490 nm下測定吸光值。

樣品的測定:稱取粗多糖樣品 0.05 g,加 10 mL蒸餾水溶于具塞試管,沸水浴 1 h,取出冷卻定容,得到樣品待測液,取樣品待測液 0.25 mL到 25 mL容量瓶,定容后取 0.5 mL稀釋液于試管中,再加 0.5 mL蒸餾水、0.5 mL 5%苯酚和 2.5 mL的濃硫酸,振蕩混勻,沸水浴 15 min,迅速在冰水中冷卻,之后在490 nm下測定吸光值。根據標準曲線,換算出稀釋后的多糖量。

根據標準曲線換算出樣品μg數,計算公式如下:

(0.9為用葡萄糖做標準曲線測糖含量的校正系數)

2.3 離子色譜(HPAEC)法測定粗多糖中的單糖組成

分別取 2 mg八種桑黃粗多糖樣品放入薄壁長試管中,加入 2 mol/L的三氟乙酸 (TFA)4 mL,在110℃下水解 2 h,試管內溶液減壓蒸干 (溫度控制在 40℃下),然后加入 3 mL甲醇蒸干,重復 4～5次,以完全除去 TFA,用超純水定容至 100 mL容量瓶,稀釋一定倍數后上樣測定。使用 9種糖標品做比較。離子色譜條件:使用戴安 Dionex I CS2500系統,包括:GS50四元梯度泵、ED50A電化學檢測器(金電極)、LC30柱溫箱 (30℃);進樣量 25μL; Chromeleon 6.5色譜工作站;CarboPac PA-20陰離子交換分析柱 (150 mm×3 mm i.d.);0.45 mL/min的流速,柱溫 30℃;流動相為純水和 0.25 M NaOH[8,9]。

2.4 蛋白質含量檢測

分別稱取八種桑黃粗多糖樣品 10 mg于 20 mL具塞試管中,加 10 mL酸解劑 (6 mol/L HCl溶液),充氮氣 1 min,至-20℃的低溫冰箱中冷凍 3 h,取出后,再次充氮氣 1.5 min,封口,然后置于 110℃的恒溫干燥箱中水解 24 h。離心,取上清液旋轉蒸發至干,加 2 mL水重復 3次,(加甲醇 3次以上,可以去酸味)。最后定容成 1 mL,上機前稀釋至氨基酸含量約為 2.5 nmol/L(稀釋 10倍),取 25μL上機。用17種氨基酸標品作為參照標準。色譜條件:使用Dionex I CS2500系統,包括:GS50四元梯度泵、ED50A電化學檢測器 (金電極)、LC30柱溫箱 (30℃);進樣量 25μL;Chromeleon 6.5色譜工作站;A-mino Pac PA-10柱(2×25 mm);流速 0.22 mL/min,柱溫 30℃,流動相為純水、0.25 M NaOH和 1 M NaAc。蛋白質含量即為 17種氨基酸含量的總和。

2.5 體外刺激淋巴細胞增殖實驗

2.5.1 小鼠淋巴細胞的制備

取 8～10周齡的雄性 C-57小鼠,頸椎脫臼處死,取脾臟,用 PBS緩沖液沖洗 3～4次。用 100目篩在培養皿中將脾臟磨碎,磨碎后的混懸液 400×g離心 6 min,去上清液,按每只小鼠 1.5 mL的量加入氯化銨溶液,混合均勻,靜置 10 min,400×g離心 6 min后,吸取上清液,加 PBS緩沖液沖洗數遍后,加入 RPM I-1640細胞培養基,后進行計數,并稀釋至細胞濃度為 2×106個/mL的溶液備用。

2.5.2 細胞增殖率的測定

將 180μL上述細胞懸液加至 96孔板中,每孔加 20μL樣品 (用 50、200、500μg/mL三種濃度的樣品做同種材料的比較),以 20μL PBS和 20μL, 60μg/mL的 PHA分別做陰性和陽性對照,于 37℃,5%的 CO2培養 72 h后,每孔加入 20μL Alamar Blue試劑,再培養至變色,加 Alamar Blue前以及變色后,分別用 EL ISA自動讀板測定 570 nm和 600 nm處的吸光值,然后根據 Alamar Blue試劑公式計算各種樣品對淋巴細胞的增值率。

3 結果分析

3.1 桑黃八種水溶性粗多糖的得率和多糖含量

本實驗采用了沸水浴提取的方法,從提取結果來看,八種桑黃樣品的粗多糖得率在 1%～3%之間,相對較高的是 PB-10P、MYSHP、JSHP、PLSHP,都在 2%以上,其中 PB-10最高為 2.9%,PLSHP次之為 2.22%,MYSHP、JSHP比較接近分別為 2.11%和2.13%,其他品種的粗多糖得率相對較低,其中最低的是CSH。

多糖含量最高的是 PB-10P,達 48.3%,NFSHP和 JSHP的多糖含量都在 40%左右,分別為 39.2%和 41.5%,含量最低的是 KSHP,另外四種樣品多糖含量接近,樣品的多糖含量在 35%～39%之間 (如表 1所示)。

表 1 八種桑黃子實體粗多糖的得率和多糖含量Table 1 Crude extract yields and Polysaccharide content from eightPhellinus

3.2 桑黃單糖的組成

HPAEC測定結果(圖 1、表 2)顯示,PB-10P、PI-12P、CSHP、JSHP、KSHP和 PLSHP六種桑黃多糖的單糖組成相似,但糖比例有一定的差異,均含有巖藻糖 (fucose)、阿拉伯糖 (arabinose)、半乳糖 (galactose)、葡萄糖 (glucose)、木糖 (xylose)和甘露糖(mannose)這六種單糖成分 (圖 1);NFSHP和MYSHP的糖組成較為相似,且糖比例 (除葡萄糖外)較接近 (圖 1)。

圖 1 標準單糖和八種桑黃粗多糖的 HPAEC圖譜Fig.1 Standard monosaccharides and eight different kinds of Phellinus Polysaccharide HPAEC map

另外根據 HPAEC的測定結果,八種桑黃粗多糖樣品的單糖組成成分與 9種單糖標品相比較發現,八種樣品均含有一種標品中沒有的單糖成分,出峰時間大約在 6 min左右,該單糖峰在八種樣品中的含量略有差異。

3.3 桑黃粗多糖中蛋白質含量和氨基酸組成

采用離子色譜對酸水解后的八種桑黃樣品進行檢測,結果顯示(表 3),八個樣品中含有的氨基酸種類和比例均有所不同。

八種粗多糖中的蛋白質含量有所差異,其中含量最大的是 PB-10,其蛋白質含量為 10.8%,并且包含了六種人體必須氨基酸;其次為 JSHP,含量為7.6%,含有大部分必需氨基酸;PI-12P、MYSHP、KSHP和 PLSHP的蛋白質含量較為接近,CSHP和NFSHP的含量較少分別為 2.8%和 3.0%。

表 2 八種桑黃的單糖組成比例(摩爾比)Table 2 Monosaccharide composition of eight Phellinus

表 3 八種桑黃樣品中 17種氨基酸的組成含量及蛋白質含量(%)Table 3 17 kinds of amino acid and the protein content in eight Phellinus samples

3.4 體外刺激淋巴細胞增殖實驗

從八種桑黃粗多糖的體外免疫活性試驗結果(圖 2)可以看出,對同一種桑黃樣品而言,體外對淋巴細胞的增殖作用隨多糖濃度增大而增強,具有劑量依賴性,八種桑黃水溶性粗多糖都表現出一定的體外免疫活性,其中 PB-10P與 JSHP的活性相對其它六種樣品較高。

4 討論

通過對桑黃粗多糖中多糖及蛋白質含量的測定發現,樣品 PB-10和 JSH的多糖含量以及蛋白質含量都相對其他樣品較高,其中特別是 PB-10品種,不論是各活性成分含量還是體外對淋巴細胞的增殖作用都較其他的樣品有明顯優勢。

圖 2 桑黃水提粗多糖對淋巴細胞的增殖作用植物凝集素(PHA)為陽性對照,其增值率為 340.35%Fig.2 Effects of crude polysaccharide fractions on mouse splenocyte proliferation in vitroPHA served as positive control,and its appreciation rate is 340.35%

結合桑黃粗多糖中氨基酸組成以及單糖組成的實驗數據進行分析,可以看出,八種桑黃子實體的化學組成有一定的差異,但個別種類之間存在相似性,如在單糖的組成方面NFSH和MYSH比較接近,其他六種樣品的粗多糖在單糖組成上相近。在八種粗多糖樣品的結合蛋白中,均有賴氨酸等 6種人體必須氨基酸,這些共性特征,為層菌孔屬桑黃的鑒別提供了必要的參考。

多糖在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結構材料,更重要的是參與了生命現象中細胞的各種活動[10]。多糖對免疫系統有重要的調節作用,不僅能激活巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)、細胞毒 T細胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細胞 (LAK)等免疫細胞,還能促進細胞因子生成,活化補體,從而在抗腫瘤、抗病毒以及抗衰老等的防治上具有獨特的功效[11]。通過對熱水提取的八種桑黃子實體粗多糖進行體外免疫活性測定的結果來看,八種樣品都具有一定的活性;同比八種樣品,PB-10和 JSH兩種桑黃粗多糖的體外活性較其他樣品有明顯的優勢。由于 PB-10和JSH較其他的六個品種有較高的多糖含量和蛋白質含量,可以推測,對淋巴細胞的增殖作用與其所含的多糖及蛋白質有著密切的關系。桑黃多糖對淋巴細胞的增殖作用只表明了其體外的免疫活性,還需做動物試驗進一步確證其體內免疫活性作用。

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Comparison of Chem ical Compositions and vitro Immunological Activities of Eight Kinds of Crude Polysaccharides fromPhellinussp.

1Shanghai Nor m alUniversity,college of life and environm ent science,shanghai 200234,China;2Key Laboratory of Applied M ycological Resources and U tilization,M inistry of Agriculture,the People’s Republic of China;Shanghai Research Center for Edible Fungi B iotechnology and Engineering;Institute of Edible Fungi, Shanghai Academ y of Agricultural Sciences,shanghai,201106,China

Eight kinds of crude polysaccharideswere extracted by hotwater from differentPhellinus fruitbodies followed by ethanol precipitation.The polysaccharide and protein contents of eight different samples were deter mined,and the monosaccharides and amino acids compositions of each sample were analyzed. Immuno-enhancing activitywas evaluated by determining the affect of different polysaccharide fractions on mouse spleen lymphocyte proliferationin vitro.The results showed that the polysaccharide and protein contentsof eight crude polysaccharides had a certain extent differences. Monosaccharide composition and type and content of amino acids also existed some differences in eight crude polysaccharides.Eight different polysaccharides all showed enhancing splenocyte proliferation effect in vitro.and PB-10P and JSHP had high cell proliferation rates with 50μg/mL concentrations.The two samples had higher polysaccharide and protein contents comparedwith other samples.The results indicated in some extent the immune activity of crude polysaccharideswere correlation with the polysaccharied and protein contents and compositions of each sample.

polysaccharides ofPhellinus;monosaccharide constituents;amino acid constituents;immuno-enhancing activity

Q51;Q53

A

1001-6880(2010)05-0873-05

2009-09-04 接受日期:2009-11-03

食用菌深加工關鍵技術研究與示范項目[滬農科攻字(2008)第 8-2號]

＊通訊作者 Tel:86-21-62209765;E-mail:yangyan@saas.sh.cn

WANGQin-bo1,2,Y ANG Yan2＊,ZHOU Shuai2,LIU Yan-fang2,ZHANG Jin-song2,T ANGQing-jiu2,FENGNa2,WU di2