當歸及其炮制品水提物體外抗脂質過氧化作用

魏彥明,郭延生,曲亞玲,華永麗,鄧紅娟

甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070

當歸及其炮制品水提物體外抗脂質過氧化作用

魏彥明＊,郭延生,曲亞玲,華永麗,鄧紅娟

甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070

為了研究當歸及其不同炮制品水提物抗脂質過氧化的作用。采用體外小鼠肝組織自發性脂質過氧化、H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化和溶血反應,評價了當歸及其炮制品水提物對脂質過氧化的抑制作用。結果表明當歸及其不同炮制品水提物體外對肝組織自發性脂質過氧化的抑制能力為當歸碳 ＞酒當歸 ＞生當歸 ＞油當歸 ＞土當歸;對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的抑制能力為當歸碳 ＞土當歸 ＞生當歸 ＞酒當歸 ＞油當歸;對 H2O2誘導的溶血作用的抑制能力為酒當歸 ＞當歸碳 ＞土當歸 ＞油當歸 ＞生當歸,且抑制效果均呈現良好的劑量依賴關系。說明當歸及其不同炮制品水提物體外都具有一定的抗脂質過氧化的作用,其中抗肝組織自發性脂質過氧化和 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的能力以當歸碳最好,而抗 H2O2誘導的溶血作用以酒當歸最好。

當歸;炮制品;水提物;脂質過氧化

當歸為傘形科多年生草本植物當歸Angelicasinesis的根,主產于甘肅岷縣,歷代多以甘肅岷縣所產作為道地藥材。此外,四川、云南、湖北等省也有栽培。其藥用歷史悠久,歷代本草均有記載,《神農本草經》謂之“當歸味溫,主呃逆上氣”被列為中品。有補血、活血、調經止血、潤腸滑腸之功效[1],為醫家常用,素有“十方九歸”之稱。目前臨床常用的炮制品有生當歸、酒當歸、土當歸和當歸碳[2],除此之外,甘肅習用油當歸,并被載入《甘肅省中藥炮制規范》[3],前人有“油當歸偏于養血潤腸,酒當歸偏于活血,當歸碳偏于止血之說”。現代藥理研究表明,當歸在心血管系統、血液系統、免疫系統、抗損傷及保護方面均顯示良好的藥理作用,且具有一定的抗氧化和清除自由基的作用,對腦缺氧、缺血后再灌注腦組織脂質過氧化增高具有明顯的抑制作用[4],但能否在體外重現這種作用、提供直接證據,尚需進行研究,目前關于上述炮制品抗脂質過氧化的作用的研究報道較少。因此,探討當歸不同炮制品對小鼠肝勻漿脂質過氧化、紅細胞膜脂質過氧化和溶血的抑制作用,可為當歸臨床用藥和炮制理論提供更加科學合理的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠,18～22 g,雌雄各半,由蘭州大學醫學院實驗動物中心提供,實驗設施合格證號和動物合格證號為 SCXK(甘)20050007。

1.2 試劑

三氯醋酸、鹽酸、H2O2和 L-抗壞血酸等均為國產分析純,硫代巴比妥酸 (TBA),三 (羥甲基)氨基甲烷 (Tris)為進口上海分裝。

1.3 儀器

Lambda7島津紫外/可見光分光光度計 (日本),T10組織勻漿機 (德國),AL104電子分析天平(德國),加樣器(Eppendorf公司),TBZ5-WS多管架自動平衡離心機 (湘儀),CW-2000型超聲-微波協同萃取儀 (上海),RE-6000旋轉蒸發儀 (上海), SHA-B水浴恒溫振蕩器(江蘇)。

1.4 藥物

當歸的原藥材采于甘肅岷縣,經甘肅中醫學院中藥學系龍全江副教授和甘肅農業大學動物醫學院中獸醫教研組作生藥學鑒定。取原藥材,除去雜質,洗凈,潤透,切成薄片,曬干作為為生當歸。其炮制品油當歸、酒當歸、當歸碳、土當歸均按《甘肅省中藥炮制規范》和《全國中藥炮制規范》要求,由甘肅中醫學院龍全江副教授指導炮制。

2.3 當歸及其炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的抑制作用

2 實驗方法

2.1 當歸及其炮制品水提物的制備

取生當歸及其炮制品各 100 g,加蒸餾水 300 mL,85℃超聲-微波協同提取 2次,每次 30 min。合并兩次提取液,減壓濃縮至質量濃度 1 g/mL浸膏,4℃保存備用,測試時精密吸取,作適當稀釋。

2.2 當歸及其炮制品水提物對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用

采用 TBA比色法略作修改[5],實驗設空白管、對照管、加藥管和藥物底管。取 5%肝組織勻漿上清液 1 mL分別加入對照管和加藥管,空白管和藥物底管加 1 mL生理鹽水。加藥管和藥物底管加入不同濃度的生當歸及其炮制品水提液 0.05 mL,空白管和對照管加入蒸餾水 0.05 mL,搖勻 37℃恒溫水浴振蕩 2 h,各管加入 20%TCA 0.3 mL,0.1 mol/L HCl 2 mL,0.67%TBA 1 mL,沸水浴 15 min,自來水流水冷卻,3000 r/min離心 10 min,以空白管標零,取上清液于 532 nm處測定吸光度A,按下式計算抑制率:

參照文獻方法略作修改[6],實驗設空白管、對照管、加藥管和藥物底管,取 0.5%紅細胞懸液 0.5 mL加入到空白管、對照管和加藥管,藥物底管加生理鹽水 0.5 mL,各管再加入生理鹽水 1 mL,加藥管和藥物底管加入不同濃度的生當歸及其炮制品水提液 0.05 mL,對照管和加藥管分別加入 300 mmol/L H2O20.1 mL,空白管和藥物底管加 0.1 mL生理鹽水,搖勻,37℃恒溫水浴振蕩 2 h,加入 20%TCA 0.3 mL,0.1 mol/L HCl 2 mL,3500 r/min離心 15 min,取上清液 3 mL加入 0.67%TBA 1 mL,沸水浴15 min,自來水流水冷卻,以空白管標零,于 535 nm處測定吸光度A,按下式計算抑制率:

2.4 當歸及其炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞溶血的抑制作用

參照文獻方法略作修改[7,8],實驗設為為對照管、加藥管和藥物底管,取 0.5%紅細胞懸液 1 mL分別加入對照管和加藥管,藥物底管加入 1 mL生理鹽水,加藥管加入不同濃度的生當歸及其炮制品水提液 0.05 mL,搖勻,37℃水浴 10 min,對照管和加藥管分別加入 300 mmol/L H2O20.05 mL,藥物底管加 0.05 mL生理鹽水,搖勻 37℃恒溫水浴振蕩 1 h,各管加生理鹽水 4 mL,3000 r/min離心 10 min,以生理鹽水標零,取各管上清液于 415 nm處測定吸光度A,按下式計算抑制率:

2.5 數據統計處理

用 SPSS 13.0統計軟件進行方差分析和回歸分析,測定結果以±s表示。

3 實驗結果

3.1 當歸及其炮制品水提物對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制效果

從表 1可以看出,生當歸、油當歸、酒當歸、土當歸和當歸碳水提物在 25～200 mg/mL劑量范圍內都對小鼠肝組織自發性脂質過氧化有一定的抑制作用,且隨藥物濃度增加,抑制率顯著升高 (P＜0.05),即藥物濃度 (X)與抑制率(Y)之間存在良好的依賴關系,擬合曲線,計算回歸方程,生當歸:y= e4.294-49.497/x,R2=0.994;油當歸:y=e4.284-54.059/x,R2= 0.969;酒當歸:y=0.579x-0.001x2-1.201,R2= 0.999;土當歸:y=0.567x-0.001x2-1.943,R2= 0.995;當歸碳:y=23.776lnX-50.315,R2=0.998。從圖 1可以看出,不同炮制品 IC50從小到大依次為當歸碳、酒當歸、生當歸、油當歸和土當歸,即生當歸及其炮制品水提物對小鼠肝組織自發性脂質過氧化能力依次為當歸碳 ＞酒當歸 ＞生當歸 ＞油當歸 ＞土當歸。表明當歸經炒碳和酒炒后對其抑制肝組織自發性脂質過氧化的能力增強,而當歸經油炒和土炒后抑制能力降低。在此試驗條件下L-抗壞血酸在 4～10 mg/mL劑量范圍內能有效抑制肝組織自發性脂質過氧化作用,I C50為 4.64 mg/mL(圖 1)。

表 1 當歸炮制品水提物體外對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用Table 1 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on mouse liver homogenates spontaneous antilipid peroxidationin vitro(±s)

表 1 當歸炮制品水提物體外對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用Table 1 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on mouse liver homogenates spontaneous antilipid peroxidationin vitro(±s)

注:1.a,b……表示同一炮制品不同濃度之間比較,不同字母表示差異顯著(P＜0.05),相同字母,表示差異不顯著(P＞0.05)。Notes:1.a,b… represents the Comparison between different Concentrations of same processed product,and difference letter has significant difference (P＜0.05),the same letter no significant difference(P＞0.05).

3.2 當歸及其炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的抑制效果

從表 2可以看出,生當歸、油當歸、酒當歸、土當歸和當歸碳水提物對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化具有一定的抑制效果,除生當歸外,其余炮制品在 25～200 mg/mL的劑量范圍內,抑制率隨著藥物濃度的增高而顯著增高 (P＜0.05),即炮制品藥物濃度(X)與抑制率(Y)之間存在著良好的依賴關系。擬合曲線,計算回歸方程,生當歸:y=34.207-0.1x+0.001x2,R2=0.997;油當歸:y=2.665x0.495, R2=0.972;酒當歸:y=e3.817-41.086/x,R2=0.977;土當歸:y=9.633+0.275x,R2=0.999;當歸碳:y= 4.097+0.410x,R2=0.989。不同炮制品對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的 I C50由小到大依次為當歸碳、土當歸、生當歸、酒當歸、油當歸 (圖 1),即抗氧化能力當歸碳 ＞土當歸 ＞生當歸 ＞酒當歸 ＞油當歸。表明當歸炒碳和土炒后增強了對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的抑制能力,而經酒炒和油炒后抗紅細胞膜脂質過氧化的能力降低。在此試驗條件下L-抗壞血酸在 4～10 mg/mL劑量范圍內能有效抑制 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化作用,I C50為 6.52 mg/mL(圖 1)。

表 2 當歸及其炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化的抑制作用Table 2 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on erythrocytic membrane anti-lipid peroxidation induced by H2O2in vitro(x ±s)

注:1.a,b……表示同一炮制品不同濃度之間比較,不同字母表示差異顯著(P＜0.05),相同字母,表示差異不顯著(P＞0.05)。Notes:1.a,b… represents the Comparison between different Concentrations of same processed product,and difference letter has significant difference (P＜0.05),the same letter no significant difference(P＞0.05).

3.3 當歸及其炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞溶血的抑制作用

從表 3可以看出,生當歸、油當歸、酒當歸、土當歸和當歸碳對 H2O2誘導的紅細胞溶血具有一定抑制作用,同一炮制品在 12.5～200 mg/mL的劑量范圍內,抑制率隨著藥物濃度的增高而呈現出不同的增高趨勢,其中生當歸和油當歸各濃度之間抑制率具有顯著差異性 (P＜0.05),酒當歸 25 mg/mL與50 mg/mL之間抑制率差異不顯著 (P＞0.05),其余濃度之間差異顯著 (P＜0.05),土當歸 12.5 mg/mL與 50 mg/mL之間差異不顯著 (P＞0.05),其余濃度之間差異顯著 (P＜0.05),當歸碳表 50 mg/mL與100 mg/mL之間抑制率差異不顯著 (P＞0.05),其余濃度之間差異顯著 (P＜0.05)。擬合曲線,計算回歸方程,生當歸:y=1.261x-0.004x2-12.349,R2=0.988;油當歸:y= e4.77-31.466/x,R2=0.998;酒當歸:y=e4.452-7.828/x,R2=0.966;土當歸:y=12.786+ 1.038x-0.003x2,R2=0.983;當 歸碳:y= e4.658-18.207/x,R2=0.969。不同炮制品對 H2O2誘導的紅細胞溶血的 IC50由小到大依次為酒當歸、當歸碳、土當歸、油當歸和生當歸 (圖 1),即抑制紅細胞溶血的能力酒當歸 ＞當歸碳 ＞土當歸 ＞油當歸 ＞生當歸。表明當歸經炮制后對 H2O2誘導的紅細胞溶血的抑制能力都有所增強。在此試驗條件下L-抗壞血酸在 4～10 mg/mL劑量范圍能有效抑制H2O2誘導的紅細胞溶血作用,I C50為 6.89 mg/mL(圖 1)。

表 3 當歸炮制品水提物對 H2O2誘導的紅細胞溶血的抑制作用Table 3 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on erythrocyte hemolysis induced by H2O2in vitro(x ±s)

4 討論

氧自由基及其介導的脂質過氧化反應參與了許多疾病的發生與發展,如動脈硬化癥、高血壓、冠心病、骨關節炎、白內障以及帕金森氏病等。現代研究表明,當歸能有效地清除超氧自由基,減少脂質過氧化反應等。但對當歸及其炮制品體外抗脂質過氧化的研究較少,僅見吳慧平等報道了當歸炭、焦當歸、酒當歸、生當歸和炒當歸水煎液對 FRGS誘導肝組織過氧化脂質的抑制作用[9]。因此,選擇臨床常用的當歸炮制品種以及多種指標評價當歸不同炮制品體外抗脂質過氧化作用,可為當歸臨床用藥和炮制理論提供更加科學合理的理論依據。

體外實驗表明,生當歸及其炮制品水提物對小鼠肝組織自發性過氧化、H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化和紅細胞溶血作用均有一定的抑制作用,其抑制作用隨著藥物濃度的升高逐漸升高,呈現良好的劑量依賴關系。但當歸及其炮制品抑制脂質過氧化的能力因選擇的評價方法不同而具有一定的差別,其抑制肝組織自發性過氧化能力為當歸碳 ＞酒當歸 ＞生當歸 ＞油當歸 ＞土當歸,這與吳慧平等報道當歸碳 ＞酒當歸 ＞生當歸一致[9];抑制 H2O2誘導的紅細胞膜過氧化的能力為當歸碳 ＞土當歸 ＞生當歸 ＞酒當歸 ＞油當歸,抑制 H2O2誘導紅細胞溶血的能力為酒當歸 ＞當歸碳 ＞土當歸 ＞油當歸 ＞生當歸。

圖 1 當歸炮制品水提液體外抗脂質過氧化 I C50Fig.1 IC50ofwater extracts from processed productsof Chinese angelica on anti-lipid peroxidation in vitro

據文獻報道,當歸水溶性成分阿魏酸和多糖都具有一定的抗氧化作用,如吳建農等報道阿魏酸不僅能對抗氧自由基,使超氧自由基、羥自由基和過氧化氫等氧自由基生成減少,而且還能與膜磷脂酰乙醇胺結合,使膜脂質不受氧自由基的侵襲,從而發揮抗脂質過氧化作用[10];李貴榮等報道,當歸多糖能夠有效的清除氧自由基和羥自由基,且純化后的當歸多糖對氧自由基和羥自由基的清除作用均小于其粗品多糖[11],凌小曼等還發現,當歸多糖能升高血瘀動物心、腦、腎、胰四臟器超氧化物歧化酶 (SOD)活性,降低心、腦、腎、胰四臟器丙二醛 (MDA)含量,具有一定的抗氧化能力[12]。另據報道,生當歸與炮制品之間阿魏酸含量有一定的差異,并且隨炮制溫度的升高,阿魏酸含量降低,以當歸炭最為明顯[13]。劉漢珍等測定了當歸及其炮制品中的多糖含量,以酒炙品中含量最高,當歸炭中含量最低[14],即當歸經炒碳后阿魏酸和多糖含量均低于生當歸,但本實驗結果表明當歸碳對肝組織自發性過氧化、H2O2誘導的紅細胞膜過氧化和 H2O2誘導紅細胞溶血的抑制能力均大于生當歸。據此推測,當歸不同炮制品抗氧化能力除與阿魏酸和多糖含量變化相關外,其抗氧化作用的成分可能還與其它未知的成分有密切關聯,很有必要進一步研究。

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Anti-lipid peroxida?tion of the Water Extracts from Processed Products of Chinese Angelicain vitro

WEI Yan-ming＊,GUO Yan-sheng,QU Ya-ling,HUA Yong-li,DENG Hong-juan
Gansu Agriculture University,College of Veterinary M edicine,Lanzhou 730070

To study the effect on Anti-lipid peroxidation of water extracts from processed products of Chinese angelica, mouse liver homogenates spontaneous lipid peroxidation,erythrocyticmembrane lipid peroxidation and erythrocyte hemolysis induced by H2O2in vitro were used to assess their capacity of Anti-lipid peroxidation.The results showed that the rate of inhibition on mouse liver homogenates spontaneous lipid peroxidation was in sequence of carbonized Angelica＞wine-broiled angelica＞raw Angelica＞oil-broiled Angelica＞Foci subsoil-broiled angelica;the rate of inhibition on erythrocytic membrane lipid peroxidation induced by H2O2was in sequence of carbonized Angelica ＞Foci subsoilbroiled angelica＞raw Angelica＞wine-broiled angelica＞oil-broiled Angelica;the rate of inhibition on erythrocyte hemolysis induced by H2O2was in sequence ofwine-broiled angelica＞carbonized Angelica＞Foci subsoil-broiled angelica＞oil-broiled Angelica＞raw Angelica.And inhibition effect showed a better dose-dependent relation.It was concluded that the water extracts from processed products of Chinese angelica showed certain inhibitory effect on anti-lipid peroxidation in vitro,and carbonized product had the best inhibition on liver homogenates spontaneous lipid peroxidation and erythrocytic membrane lipid peroxidation induced byH2O2,butwine-broiled angelica showed the best inhibitory effecton erythrocyte hemolysis induced by H2O2.

Chinese angelica;processed products;water extracts;anti-lipid peroxidation

R285.5;Q593.1

A

1001-6880(2010)05-0878-06

2009-07-17 接受日期:2009-09-21

國家自然科學基金項目“當歸不同炮制品清除自由基和抗脂質過氧化的作用”(30671541)

＊通訊作者 Tel:86-931-7632210;E-mail:weiym@gsau.edu.cn