杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶重組蛋白的純化及其多克隆抗體制備＊

張 磊,崔柳青,李 杰,劉紅濤,薛樂勛

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶重組蛋白的純化及其多克隆抗體制備＊

張 磊,崔柳青,李 杰,劉紅濤,薛樂勛#

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者,男,1944年 2月生,本科,教授,研究員,研究方向:腫瘤標志物與基因工程,E-mail:xuelx@371.net

葡萄糖-6-磷酸異構酶;原核表達;抗體制備;杜氏鹽藻

目的:純化杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶 (GPI)重組蛋白,制備多克隆抗體。方法:PCR擴增得到兩端分別添加 NdeⅠ和 EcoRⅠ酶切位點的 GPI基因,雙酶切后插入原核表達載體 pET28a(+),得到重組載體 pET28a-GPI,經鑒定正確后,用該重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導表達后用鎳離子柱純化目的蛋白并免疫新西蘭白兔,間接 EL ISA和Western blot法檢測抗體的效價和特異性。結果:杜氏鹽藻 GPI基因在大腸桿菌 BL21(DE3)中得到高效表達,占總蛋白的 41.6%。以高純度的目標蛋白作為抗原免疫新西蘭白兔,得到抗 GPI的抗血清。間接 EL ISA檢測抗血清效價達到 1∶512 000,Western blot檢測證實抗血清能與目的蛋白特異性結合。結論:成功純化了杜氏鹽藻 GPI重組蛋白并制備了特異性的 GPI多克隆抗體。

葡萄糖-6-磷酸異構酶 (glucose-6-phosphate isomerase,GPI)普遍存在于真核及原核生物中,其催化葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸之間的相互轉化,在糖代謝中起到重要的作用[1]。近年來的研究結果顯示,GPI作為非常保守的酶[2],不僅參與糖代謝,而且還具有一些其他作用[3-4],如在動物細胞中作為自分泌運動因子 (AMF)促進腫瘤細胞增殖浸潤,刺激 T、B淋巴細胞移動和生長[5-6]。杜氏鹽藻是一種極其耐鹽的單細胞真核綠藻,具有雙鞭毛,可以游動,具有較強的光合作用[7]。但是目前關于杜氏鹽藻 GPI的研究仍是空白,并且沒有針對杜氏鹽藻 GPI的商業化抗體出售,也不能檢測其在蛋白水平的表達情況。該研究構建了杜氏鹽藻 GPI的重組原核表達載體 pET28a-GPI,誘導其在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達,經純化獲得高純度的重組蛋白,通過免疫新西蘭白兔,獲得了兔抗杜氏鹽藻 GPI的特異性多克隆抗體,為杜氏鹽藻 GPI蛋白水平的研究提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株與質粒 杜氏鹽藻購自美國德克薩斯州大學,大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)工程菌及pET28a(+)表達載體為鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 LA Taq DNA聚合酶,限制性內切酶EcoRⅠ和N deⅠ,反轉錄試劑盒,質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購自大連寶生物公司;T4 DNA連接酶購自 Promega公司;相對分子質量 Marker購自加拿大 MB I公司 ;異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)和山羊抗兔 IgG購自鄭州寶信生物工程公司;蛋白純化試劑盒購自 Novagen公司;PCR特異性引物由北京博尚生物技術公司合成;RNA提取試劑 Trizol購自美國 Invitrogen公司。

1.1.3 動物來源 體質量約 2 kg的雌性新西蘭白兔 2只,購自河南省農業科學院。

1.2 鹽藻細胞的培養 鹽藻常規接種到改良的Ben-Amotz鹽藻培養液中,置 23℃光照培養箱中進行培養,光照強度為 4 500 Lux,明暗周期為 12 h∶12 h。

1.3 引物的設計 根據 GenBank報道的杜氏鹽藻GPI的基因序列 (GenBank登錄號 FJ210719)設計合成引物。上游引物 UF:5’-CGCCATATGATGTTGTC CAACTTCAAGCAGG-3’;下 游 引物 UR:5’-CCG GAATTCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’。上、下游引物近 5’端分別引入N deⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

1.4 杜氏鹽藻總 RNA的提取 取對數生長期的鹽藻細胞,用 Trizol試劑提取鹽藻細胞總 RNA。通過 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳判斷 RNA的完整性,通過測定A(260 nm)/A(280 nm)判斷 RNA的純度。

1.5 PCR擴增杜氏鹽藻 GPI cDNA序列 取 1μg RNA作逆轉錄模板,隨機引物作逆轉錄引物,總反應體積為 20μL。變性 70℃5min后迅速冰浴,依次加入 4μL反應緩沖液、1μL RNase抑制劑和 2μL dNTP混合物,37℃5min后加 1μL M-MLV逆轉錄酶,37℃60min,70℃10min結束反應。取上述反轉錄的 cDNA為模板用特異性引物 UF和 UR進行 PCR擴增。反應體系 (50μL)包括:cDNA模板 1μL,10×Buffer 5μL,dNTP 4μL,上游引物 UF 1μL,下游引物 UR 1μL,LA Taq DNA聚合酶 0.5μL及無菌水 37.5μL。反應條件為:94℃預變性 5min;94℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 2min;30個循環后 72℃延伸 5min。擴增完畢后置 4℃終止反應。

1.6 杜氏鹽藻 GPI原核表達載體的構建EcoRⅠ、NdeⅠ雙酶切杜氏鹽藻 GPI PCR產物和 pET28a(+)原核表達載體,經 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果,膠回收、純化,分別得到含有相同黏性末端的 GPI基因片段和 pET28a(+)線性載體片段,經16℃過夜連接、轉化大腸桿菌 DH5α和篩選陽性克隆后,將初步鑒定正確的菌株送北京博尚生物技術公司測序以確定讀碼框是否正確。

1.7 pET28a-GPI在 BL21(DE3)中的誘導表達用經測序確認正確的 pET28a-GPI重組質粒轉化感受態 BL21(DE3)工程菌,之后涂于含有卡那霉素的瓊脂平板上,37℃過夜培養,挑取克隆接種于含有100 mg/L卡那霉素的溶菌肉湯 (LB)液體培養基中,37℃振蕩培養,經吸光度 (A)檢測,至A(600 nm)約為 0.6時,加入 IPTG繼續振蕩培養,取 1 mL菌液,離心收集菌體,棄上清,沉淀用 100μL的 1×SDS上樣緩沖液重懸,100℃煮沸 5min,取 20μL上樣于 120 g/L SDS-PAGE進行不連續蛋白電泳。以未轉化 BL21(DE3)菌株作為對照。分別將 IPTG誘導時間設定為 1、2、3、4和 5 h,根據蛋白表達量的多少確定最佳誘導時間;之后分別將 IPTG誘導濃度設定為 0.5、1.0、2.0、3.0和 4.0 mmol/L,在最佳誘導時間誘導,確定最佳誘導濃度。

1.8 目標蛋白的純化 在優化條件下誘導表達菌大量擴增 (800 mL),5 000 r/min離心 10min收集菌體,PBS洗滌 2次,80 mL裂解緩沖液 (PBS,10 mg/L溶菌酶,體積分數 1%Triton X-100,pH 8.0)重懸菌體,4℃放置過夜。待菌液變得黏稠后,超聲破碎進一步裂解細菌,超聲破碎后的懸濁液 7 500 r/min離心 20min,分別取少量上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳,確定目的蛋白的表達形式主要是不可溶的包涵體,故棄上清。包涵體沉淀經洗滌液(PBS,8 mol/L尿素,體積分數 1%Triton X-100)多次洗滌后用包涵體溶解液 (PBS,6 mol/L尿素,質量分數 0.01%β-巰基乙醇)4℃過夜溶解,經 0.45 μm微孔濾膜過濾,上樣于已平衡的組氨酸標簽純化樹脂 (Ni2+-NTA-Resin)柱上,經過結合和洗滌緩沖液洗柱,最終以洗脫緩沖液 (6 mol/L尿素,4 mol/L NaCl,0.5 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脫目的蛋白。目的蛋白溶液經含 2 mol/L尿素的 PBS緩沖液 4℃透析 48 h后,進行 SDS-PAGE蛋白電泳,分析純度。

1.9 GPI多克隆抗體的制備及抗體效價、特異性測定 將透析好的杜氏鹽藻 GPI重組蛋白溶液定量后,分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等體積混勻,超聲波法使其完全乳化,皮下多點免疫新西蘭白兔,每只免疫蛋白量為 1 mg。首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化的抗原,以后均采用弗氏不完全佐劑乳化的抗原。間隔 14 d進行第 2次免疫,抗原量減半。以后每隔 7 d加強免疫 1次,共加強免疫 5次。末次免疫 8 d后,頸動脈插管取血,分離血清,稀釋1 000倍,依次倍比稀釋,按照間接 EL ISA方法測定抗體效價。以制備的兔抗 GPI多克隆抗體為一抗,1∶2 000稀釋后進行Western blot,檢測抗體特異性。

2 結果

2.1 杜氏鹽藻總 RNA的提取和 PCR擴增杜氏鹽藻 GPI cDNA序列 用 Trizol試劑從杜氏鹽藻細胞中提取總 RNA,純度和完整性符合 RT-PCR要求。以杜氏鹽藻總 RNA為模板進行 RT-PCR,擴增出約2 000 bp的特異條帶與 NCB I登錄的杜氏鹽藻 GPI cDNA長度基本一致 (圖1)。

圖1 杜氏鹽藻 GPI的 RT-PCR電泳圖1,2:杜氏鹽藻 GPIRT-PCR結果;M:DNA Marker。

2.2 原核表達載體 pET28a-GPI的鑒定 重組原核表達載體 pET28a-GPI經EcoRⅠ和NdeⅠ雙酶切后出現約 2 000 bp的 DNA條帶 (圖2)。經測序,插入片段長 1 980 bp,編碼 659個氨基酸,且讀碼框正確。

2.3 重組質粒在大腸桿菌 BL21(DE3)中的表達與純化 SDS-PAGE結果顯示表達菌在相對分子質量為 75 000處有一新條帶,而對照菌株沒有 (圖3)。蛋白表達量在誘導 4 h后無明顯增加。在不同IPTG濃度誘導下,GPI的表達量有差異。優化誘導條件為 3 mmol/L IPTG 37℃下連續誘導 4 h,目的蛋白表達量最高可達 41.6%。純化后 GPI純度達到 96%,符合進一步免疫動物的抗原純度要求。

2.4 GPI多克隆抗體的效價和特異性 間接EL ISA結果顯示所制備的兔抗杜氏鹽藻 GPI多克隆抗體滴度為 1∶512 000。以制備的多克隆抗體為一抗,1∶2 000進行抗體特異性檢測,Western blot結果顯示抗體具有較高的特異性 (圖4),能夠用于在蛋白水平檢測杜氏鹽藻 GPI的表達。

圖4 兔抗 GPI多克隆抗體的W estern blot結果1:pET28a(+)轉化的 BL21;2～4:分別為 IPTG誘導 1、2和3 h的 GPI蛋白。

3 討論

GPI基因序列已經在多種生物中得到克隆,除了在糖酵解和糖異生等糖代謝過程中具有重要作用外,它還具有的一些新作用正逐漸被發現。在動物細胞中,GPI作為 AMF與細胞表面的受體 (AMFR)結合后能夠促進腫瘤細胞的增殖和轉移[8]。杜氏鹽藻作為一種單細胞真核綠藻,其 GPI除了參與基本的糖代謝作用外,其他的功能尚不清楚。目前對杜氏鹽藻 GPI的檢測仍處于基因水平,缺少特異性的抗體成為制約對其研究的瓶頸。該研究通過制備杜氏鹽藻 GPI多克隆抗體使在蛋白水平上研究杜氏鹽藻 GPI的表達成為了可能,同時也為通過免疫共沉淀技術尋找杜氏鹽藻細胞內能夠與 GPI相互作用的潛在受體蛋白奠定了物質基礎。

由于 GPI天然蛋白表達量低,缺少合適的純化標簽,因而利用天然蛋白作為抗原制備抗體缺乏可行性。但是,以大腸桿菌為代表的原核表達系統則具有高效、快捷、成本低及周期短等特點,而且使用攜帶純化標簽的商業化載體,使目標蛋白的純化簡單易行,因此成為制備蛋白抗原的最佳選擇。

該研究將杜氏鹽藻 GPI基因按照正確的閱讀框架定向插入到原核表達載體pET28a(+)中,經IPTG誘導使兩端分別具有 6個組氨酸標簽的重組蛋白高效表達,表達量約占菌體總蛋白的 41.6%,為后續的分離純化提供了良好的條件。

由于 GPI蛋白相對分子質量高達 75 000,并且具有 3對二硫鍵,所以無論降低誘導溫度還是誘導物濃度,目標蛋白均以包涵體形式表達。包涵體蛋白純度較高,易于分離純化,使制備的抗原純度較高,增加了所制備抗體的特異性。

蛋白的免疫原性與其相對分子質量成正比,杜氏鹽藻 GPI蛋白相對分子質量高達 75 000,容易引起動物免疫反應。為了提高動物的免疫應答,在第1次免疫后每隔 3 d給新西蘭白兔注射 2 mL聚肌胞,共注射 4次,以增強抗體形成,刺激巨噬細胞的吞噬作用[9],并且在最后 2次加強免疫中加倍了抗原量,大大促進了抗體的形成。

總之,該抗體的制備為在蛋白水平檢測杜氏鹽藻 GPI的表達提供了重要工具。對杜氏鹽藻 GPI蛋白水平的研究將更進一步揭示其潛在的功能。

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(2010-01-07收稿 責任編輯姜春霞)

Purification ofDunaliella salinaglucose-6-phosphate isomerase recombinant proteins in engineering bacteria and preparation of their polyclonal antibody

ZHANG Lei,CU I L iuqing,L I Jie,L IU Hongtao,XUE Lexun
Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

glucose-6-phosphate isomerase;prokaryotic expression;preparation of polyclonal antibody;Dunaliella salina

A im:To purifyDunaliella salinaglucose-6-phosphate isomerase(GPI)recombinant proteins in engineering bacteria and to prepare their polyclonal antibody.Methods:A recombinant prokaryotic expression vector pET28a-GPI was constructed after the GPI gene fragmentswere successfully inserted into theNdeⅠ-EcoRⅠ sites of pET28a(+).The total proteins ofE.coliBL21(DE3)transfor med with pET28a-GPIwere analyzed by SDS-PAGE after induction of IPTG.The recombinant proteins purified byNi2+-NTA-Resin were used to immunize 2 New Zealand rabbits,and the specificity and sensitivity of anti-sera were characterized by Western blot and EL ISA,respectively.Results:The GPI gene was expressed effectively inE.coliBL21(DE3).The recombinant proteins were up to 41.6%of the total expressed proteins.Western blot showed that the anti-sera from the immunized New Zealand rabbits bound specificly to target proteins and the titer of anti-sera was 1∶512 000 by EL ISA.Conclusion:Polyclonal antibody against GPIwith high specificity and sensitivity has been prepared using purified GPI as antigens.

Q786

＊科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240;國家自然科學基金資助項目 30700014