拉米夫定對慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2細胞因子和肝纖維化指標的影響

鐘水清，樓克忻

(浙江省松陽縣人民醫院感染科，浙江 麗水 323400)

目前研究認為，病毒和機體免疫狀態是乙型肝炎病毒(HBV)感染人體后病情發展方向的決定因素，而Th應答類型與機體的免疫狀態密切相關[1]。正常情況下Th1/Th2處于動態平衡中，Th1/Th2的不平衡激活可造成疾病的不同病理狀態，Th1/Th2比例是否失衡是制約機體能否有效清除病毒和病毒感染細胞的主要因素之一[2]，而干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)是維持Th1/Th2細胞比例的關鍵分子。拉米夫定是一種能強烈抑制HBV復制的雙脫氧核苷類藥物，是目前廣泛應用的抗HBV藥物，Th1/Th2的平衡失調可能是拉米夫定長期應用易發生變異、停藥后易發生反跳的原因[3]。本研究觀察了拉米夫定對慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2細胞因子、HBV-DNA含量及肝纖維化指標的影響，以探討其治療慢性乙型肝炎的療效及作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年1月至2009年6月在我院感染科門診或住院治療的輕中度慢性乙型肝炎患者50例作為治療組，其中男34例，女16例;年齡20～59歲，平均(35.7±9.2)歲;診斷參照2000年中華醫學會制訂的病毒性肝炎診斷標準[4]，治療前HBV-DNA均陽性，排除其他類型肝炎病毒重疊感染。以正常健康體檢者30例作為對照組，其中男20例，女10例;年齡18～60歲，平均(34.8±9.7)歲。兩組患者的性別、年齡比較無統計學差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法

治療組患者給予拉米夫定片(葛蘭素制藥有限公司)100 mg，每日1次，療程為6個月。

1.3 觀察指標

分別在治療前和治療6個月后檢測治療組患者外周血Th1和Th2細胞因子、HBV-DNA及肝纖維化指標的變化，而對照組只測定1次。抽取靜脈血4 mL，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，常規分離外周血單核細胞(PBMC)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，10%FCS-1640培養液調細胞濃度為2×106/mL，接種入24孔細胞培養板，每孔1 mL，做3個復孔，用植物血凝素(PHA)誘導其增殖，終質量濃度為200 μg/mL，置37℃及5%CO2孵箱中培養48 h，收集上清液，置-80℃備檢。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測上清液中IL-4和IFN-γ含量，試劑盒購于深圳晶美生物工程有限公司。采用熒光探針聚合酶鏈反應(PCR)法檢測HBV-DNA，試劑盒購自上海復星生物技術有限公司。采用放免分析法檢測肝纖維化指標如透明質酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏蛋白(LN)，試劑由上海海軍醫學研究所提供。

1.4 統計學方法

2 結果

兩組觀察指標比較見表1。可見，與對照組比較，治療組患者外周血培養上清液PBMC中IFN-γ水平明顯下降(P＜0.01)，而IL-4水平明顯上升(P＜0.01);經拉米夫定治療6個月后，IFN-γ水平明顯上升(P＜0.05)，而IL-4水平(P＜0.05)和HBV-DNA含量明顯下降(P＜0.01)。經拉米夫定治療6個月后，治療組患者肝纖維化指標均較治療前明顯下降(P＜0.05)。

表1 兩組觀察指標比較(±s)

表1 兩組觀察指標比較(±s)

注:與對照組比較，＊P ＜0.01;與治療前比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 外周血培養上清液PBMC中細胞因子水平和HBV-DNA含量(ng/L) 肝纖維化指標(μg/L)HA IL-4 45.15±13.89 85.24±26.69＊54.56±18.62△IFN-γ 272.45±69.86 157.94±41.75＊237.45±50.62△HBV-DNA PCⅢ Ⅳ-C LN對照組治療組 治療前治療后2.15×108±4.19×107 5.34×105±6.52×104▲215.13±52.46 142.37±38.56△180.91±59.26 126.72±40.24△102.38±36.29 72.12±27.46△157.68±42.42 112.4±39.35△

3 討論

拉米夫定是第1個在我國和全球被批準用于治療慢性乙型肝炎的口服藥。其作用機制通過抑制HBV-DNA多聚酶的活性而發揮生物學效應，可迅速抑制HBV-DNA復制，降低HBV-DNA水平，而且能重建HBV特異性細胞免疫[5]。徐立新等[6]研究發現，拉米夫定治療乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陽性輕度慢性乙型肝炎，抑制了HBV的復制，調節了患者的細胞免疫功能，減輕了肝臟的炎癥反應及纖維化，有利于病毒的清除。何登明等[3]研究發現，拉米夫定治療慢性乙型肝炎，可以促進機體生成更多的IFN-γ，以促進抗HBV免疫恢復，Th1/Th2平衡在拉米夫定療程中的變化可以作為療效評價指標。

特定免疫應答及其效應機制主要由分泌不同細胞因子的Th亞群細胞調節，Th1細胞主要分泌白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素 -12(IL-12)、IFN-γ和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)，介導細胞免疫應答，在抵御胞內病原微生物方面起著重要作用;Th2主要分泌IL-4、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)，調節體液免疫反應，在抵御胞外病原微生物感染方面發揮作用。抗病毒是慢性HBV感染治療的一個重要手段，機體清除HBV的關鍵是健全的特異性免疫功能，抗病毒治療則可強化機體的清除病毒能力，最終清除病毒還需機體的特異性免疫功能，因此細胞免疫在抗HBV感染中起著核心作用。Th1/Th2細胞的平衡被打破在慢性HBV感染中的作用，日益受到人們關注。Th2細胞因子與HBV感染的慢性化有關，Th1型細胞因子與肝組織的炎癥活動相關，并有利于病毒的清除[7]。如果Th1細胞亞群占優勢，將促進細胞免疫反應，增強CD8+T細胞的活性，從而清除細胞內病毒，同時加重肝細胞的損傷;如果Th2細胞亞群占優勢，將促進體液免疫反應，并抑制細胞免疫反應，使細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞活性減弱，肝細胞損傷減輕。在慢性乙型肝炎中，以Th2應答為主，但隨著炎癥活動的加劇，Th1型細胞因子比例增加。Th1/Th2類細胞失衡與乙型肝炎的慢性化有關[2]。

本研究發現，慢性乙型肝炎患者存在Th1/Th2平衡失調，Th2細胞因子增多，Th1細胞因子減少，免疫狀態由Th1向Th2“克隆漂移”，這是造成HBV持續感染的主要原因。另外研究還發現，拉米夫定既能抑制HBV-DNA復制，又能調節Th1/Th2細胞因子比例平衡，使免疫反應由Th2型向Th1型逆轉。其作用機制可能是，拉米夫定可促進Th1細胞發育，抑制Th2細胞發育，進而促進IFN-γ等Th1細胞因子的分泌，抑制IL-4等Th2細胞因子的分泌，提高細胞免疫反應，抑制體液免疫反應，增強CD8+T細胞的活性，從而清除細胞內病毒，降低血清HBV-DNA的含量。

肝纖維化是許多慢性肝病的共同病理特征。其實質是肝臟的損傷與愈合反應過程，結果是肝臟的細胞外基質(ECM)的產生超過其降解，從而使過多的ECM沉積于肝臟組織，導致肝臟正常結構的破壞、重構及肝功能的損傷[8]。反映肝細胞ECM代謝的血清學指標有HA，LN，PCⅢ，Ⅳ-C等。近年來對肝組織學和血清肝纖維化指標相關性的研究結果表明，血清肝纖維化指標和肝組織纖維化程度有良好的相關性，并與肝組織纖維化發展的階段性一致[9]。因此，檢測血清肝纖維化指標ECM產物的含量可客觀地推測肝細胞損傷及纖維化程度。本研究結果提示，拉米夫定能抑制肝內ECM和膠原的合成，對肝纖維化有一定療效，與胡冰等[10]的報道一致。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者存在Th1/Th2平衡失調，拉米夫定通過調節Th1/Th2細胞的平衡，可有效抑制HBV的復制，降低患者血清中肝纖維化指標的水平，從而達到清除細胞內病毒、防治肝纖維化的目的。

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