吉林市麻疹病毒流行株M和N基因特征分析

李立杰

吉林市麻疹病毒流行株M和N基因特征分析

李立杰

麻疹是兒童常見的一種急性傳染病，其傳染性很強，以皮丘疹、發熱及呼吸道癥狀為特征。我國自20世紀60年代初應用減毒活疫苗以來，發病率顯著下降。但每年在全球仍有散發患者，并在一定范圍內造成流行，引起死亡。麻疹病毒只有一種血清型，但近年對其基因的分析發現，麻疹病毒有8個基因組，23個基因型。在不同地區和時間流行株的基因型不同，通過對麻疹病毒基因型可以進行病原學分析，判斷傳染源和傳播途徑。

1 材料與方法

1.1 標本來源采集2007～2008年吉林市疑似麻疹患者出疹1～5 d內咽拭12份和尿液6份，同時采集咽拭和尿液5份。咽拭采集后置于2～3 ml含2%小牛血清、終濃度為1000 U/ml的青霉素和鏈霉素、50U/ml制霉菌素的DMEM中標本運輸液中，尿標本采集10～50 ml，-20℃凍存。

1.2 總RNA提取及H、M基因的RT-PCR總RNA提取采用Trizol(Invitrogen，US)法。根據美國疾病預防控制中心數據［1］和文獻［2］設計N和M基因引物如下。麻疹病毒核蛋白(N)基因引物:上游序列5’-ACTACAATCAGAGGTCAATTC-3’，下游序列5’-AGCATGTCTCCATTCGCAACT-3’，用于擴增N基因羧基末端的571bp的片段。麻疹病毒基質蛋白(M)基因引物:上游序列5’-ACGCGTCGACAAAAAACTTA-3’，下游序列5’-ATCCGGGTCGTTTTCGGGCA-3’，用于擴增M基因中的188bp片段。RT-PCR使用大連寶生物TaKaRa RNA PCR kit(AMV)試劑盒，嚴格按照試劑盒說明取1μl麻疹病毒的RNA提取物作為模板合成cDNA，再PCR擴增所需的兩個(N和M)目的片段。每次同時取北京天壇生物制品股份有限公司生產的凍干麻疹活疫苗株長春-47(批號:2005081101)做陽性對照，取雙蒸水做陰性對照。

1.3 核酸序列的電泳、回收純化和鑒定將N、M基因片段PCR擴增產物，經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。PCR的產物在紫外燈下切割，經天為時代凝膠回收試劑盒回收和純化，送上海生工生物技術公司測序。

1.4 核酸序列分析采用SeqEd．V 1.0.3程序對核酸序列相應的氨基酸序列及基因差異進行計算機分析。采用DNA STAR軟件MegAlign程序，對N和M基因片段的核酸序列做序列系統樹分析。

2 結果

2.1 麻疹病毒分離及鑒定結果本次從尿液標本中分離到3株麻疹病毒，分離陽性率為16.67%;從咽拭標本中分離到4株麻疹病毒，分離陽性率為22.22%。尿液標本分離率低于咽拭標本，但二者沒有統計學意義。見圖1、2。

2.2 RT-PCR結果，疫苗株和患者標本均擴增得到約N基因600 bp、M基因200 bp核酸片段。陰性對照則無此片段。

2.3 對7個標本的N基因450 bp的核酸序列與GenBank中的22個基因亞型做序列系統樹。2007年3個流行株之間同源性為99.8%，2008年4個流行株之間同源性為100%，即核酸序列完全相同，屬同一流行株，但不同于疫苗株長春-47。兩年之間流行株的差異率為0.4%。與世界其他22個麻疹病毒代表株的差異率為6.6%～10.9%。

3 討論

麻疹是一種傳播迅速、波及廣泛的傳染病。盡管麻疹病毒被認為是單一血清型別，但是序列分析表明，存在著截然不同的麻疹野病毒基因型并共同在人類中傳播。從本次麻疹病毒基因序列的分析中可以看出，吉林市2007年分離得到的3株同源性99.8%，2008年分離得到的4株同源性100%。說明每年的流行均為同一傳染源引起，本流行期內的麻疹病毒幾乎是同源的，在持續的人與人傳播的過程中幾乎不發生基因變異。

對麻疹病毒的全基因組序列研究表明，本次分離麻疹病毒流行株N基因1408處G→A，引起氨基酸改變G→S;1421處G→A，引起氨基酸改變A→D。這些氨基酸的變異可能直接影響到蛋白質的高級結構，從而可能引起抗原性變異，對病毒的抗原性影響程度尚需進一步研究。本次對M基因相對易變序列的研究結果與國外報道相符合［3］。

雖然麻疹病毒基因分型沒有固定模式，但M、N基因分型基本一致［4］，分型均屬于H1基因型。根據序列分析和基因分型，雖然不能完全確定麻疹病毒株的地理起源，但可以更加準確直觀的確認不同流行期、不同地域的麻疹病毒株之間的關系，確定現流行的優勢毒株，為麻疹病毒流行株的監測和麻疹控制策略提供強有力的支持。

［1］Minimum N gene sequence(450 nucleotides)required for genotyping (sequence from Edmonston wildtype virus;codon start=1)．http://www．cdc．gov．

［2］WHO．Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses(Update)．WER，2001，76:241-247．

［3］Patterson JB，Cornu TI，Redwine J，et al．Evidence that the hypermutated M protein of a subacute sclerosing panencephalitis measles virus actively contributes to the chronic progressive CNS disease．Virology，2001，291(2):215-25．

［4］Michaela AR，Jennifer SR，Paul AR，et al．Review of the temporal and geographical distribution of measles virus genotypes in the prevaccine and postvaccine eras．Virol J，2005，2:87．

132021吉林省吉林市龍潭區疾病預防控制中心

2.4 測定M基因的144 bp中，流行株均有4～11 bp不同于疫苗株CHANGCHUN-47，其中JL06-1株突變有意義，其有義突變有2處，3647 bp處G→T，引起氨基酸改變V→G;3680 bp處T→G，引起氨基酸改變Q→E。與GeneBank中能引起亞急性硬化性全腦炎(subacute sclerosing panencephalitis，SSPE)代表之間的關系。

圖2 麻疹野毒株在Vero/SLAM細胞上的病變

圖1 Vero/SLAM細胞