小鼠超高硫角蛋白基因啟動子的克隆及其表達活性分析

李昊，王春生，寧方勇，2，梁洋，樸善花，安鐵洙

(1.東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040;2.東北農業大學動物科技學院，哈爾濱 150030)

小鼠超高硫角蛋白基因啟動子的克隆及其表達活性分析

李昊1，王春生1，寧方勇1，2，梁洋1，樸善花1，安鐵洙1

(1.東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040;2.東北農業大學動物科技學院，哈爾濱 150030)

目的 篩選在小鼠毛囊中具有高表達活性的內源啟動子，為建立小鼠被毛特異表達外源蛋白的轉基因技術奠定基礎。方法 以小鼠基因組為模板，克隆得到超高硫角蛋白基因啟動子超高硫角蛋白(UHS)，將其分別與pβgal-Basic和pAcGFP1-N1載體連接，構建了重組真核表達載體。采用陽離子脂質體法轉染胎鼠組織塊，分析其表達活性。結果 轉染后48 h，在藍光激發條件下可以檢測到綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠毛囊區高表達，轉染96 h后，表達減弱;此外，轉染后48 h，βgal染色結果顯示在皮膚塊的毛囊區存在藍色點狀區域。結論 UHS啟動子在小鼠毛囊中具有表達特異性。

超高硫角蛋白;啟動子;分子克隆;活性分析

隨著哺乳動物轉基因技術的快速發展，利用皮膚特異性啟動子的改變動物被毛性狀的轉基因技術備受關注。Dunn等［1］(1998)利用角蛋白啟動子帶動生長激素在轉基因小鼠的毛囊特異表達。表明在轉基因動物生產過程中，正確選擇啟動子是外源基因在特異組織表達的前提。為了克隆在皮膚中特異且高表達的超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)啟動子，本研究利用小鼠肌肉組織，克隆并分析UHS啟動子的表達活性，為建立在小鼠皮膚中特異表達外源基因新技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、載體及菌株

rTaq、KpnI、BamHI、SmaI、T4 連接酶;AseI、PstI和AlwNI(NEB);Trizol(Invitrogen);質粒小提小量試劑盒和膠回收試劑盒(Tiangen);pMD18 simple載體、TransDH5α 感 受 態 細 胞 (TRANSGEN)。pAcGFP1-N1(Clontech)，pβgal-basic; β-gal染色試劑盒(Genmed)。

1.2 小鼠基因組提取

取ICR系小鼠(SCXK:J2007-0003)肌肉組織，常規方法提取小鼠基因組。

1.3 引物設計及合成

根據GenBank中小鼠UHS啟動子序列(M27685)，利用 primer 5.0設計兩對特異性引物U1/U2和 U3/U4，其擴增后的片段長度均為686 bp。在U1/U2引物5’端分別引入 KpnⅠ和 BglⅡ酶切位點用于連接到pAcGFP1-N1載體，在U3/U4引物5’端分別引入 Nde I和 Kpn I用于連接到pβgal-basic載體。引物由大連寶生物公司合成。U1:5’-GGTACCTTGG AACATCCTGCCTAAG;U2:5’-AGATCTATGTGGAGGGAGGAGTTGT;U3:5’-CATATGTTGGAACATCCTGCCTAAG; U4: 5’-GGTACCATGTGGAGGGAGG AGTTGT。

1.4 啟動子片段的擴增

PCR 反應體系 25 μL，其中基因組 2 μL(100 ng)，dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL，rTaq buffer(10 × )2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR反應條件為:94℃預變性5 min，循環數為30，條件設置為 94℃變性 30 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，結束循環后72℃再延伸7 min。

PCR產物經過膠回收后，分別于pMD18 simple載體連接，轉化DH5α型感受態細胞，藍白斑篩選。挑取白色克隆于含有 Amp的LB培養液中搖菌，小提小量試劑盒提取質粒。

重組質粒的PCR和酶切鑒定后送Invitrogen公司測序。若測序鑒定正確，則重組質粒分別命名為U12-pMD18和 U34-pMD18。

1.5 含啟動子片段的真核表達載體的構建

pAcGFP1-N1質粒經AseⅠ和 KpnⅠ雙酶切后，回收約4 kb的載體部分，并與U34-pMD18經NdeⅠ和 KpnⅠ酶切獲得的約700 bp的啟動子部分連接，轉化，PCR鑒定和酶切鑒定后獲得重組質粒 UGFP;pβgal-Basic質粒經 KpnⅠ和 BglⅡ雙酶切后，回收約 7.5 kb的載體部分，并與 U12-pMD18經KpnⅠ和BglⅡ酶切獲得的約700 bp的啟動子部分連接，轉化，PCR鑒定和酶切鑒定后獲得重組質粒U-β-gal。

1.6 啟動子表達活性檢測

頸椎脫臼法處死懷孕18 d母鼠，75%酒精的脫脂棉對其進行處理，解剖取出子宮。在培養皿中取出子宮內的胎兒，分離胎鼠皮膚組織，用眼科鑷子仔細的去除附著在皮膚上的脂肪和結締組織基膜層，露出真皮層。

將上述分離得到的胎鼠皮膚組織置于mPBS的表面皿中清洗3～4次。漂洗后用剪刀將皮膚組織樣品剪成小塊(1 mm×1 mm ～2 mm×2 mm)。皮膚組織塊放在24孔培養板中進行培養，每孔中放入6個左右的皮膚組織小塊，每孔加入500 μL含有10%血清的 RPMI 1640培養基，加蓋并置于二氧化碳培養箱(5%CO2，37℃，飽和濕度)進行培養。采用陽離子脂質體法分別將U-GFP和-β-gal轉染組織塊。組織塊轉染24 h、48 h后取出組織塊，在帶有藍光激發裝置的倒置顯微鏡觀察報告基因(綠色熒光蛋白)的表達情況，或制作冰凍切片，試劑盒檢測β-半乳糖苷酶的表達情況。

2 結果

2.1 小鼠UHS啟動子的克隆

經條件摸索后，確定PCR擴增的最佳退火溫度及時間。以小鼠基因組為模板，引物擴的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見在約700 bp處的特異擴增帶(如圖1)。

經酶切鑒定正確的重組質粒送上海生工測序。采用DNAMAN、DNASTAR和 primer 5.0軟件進行序列的拼接和分析;并與已發表的參照序列進行比較分析。測序結果:UHS啟動子序列大小為682 bp，與GenBank上M27685(小鼠 UHS的參照序列)有98.22%的同源性;在576 bp處有依賴 DNA的RNA聚合酶識別位點 CAAT box，在599 bp處有依賴DNA的RNA聚合酶結合位點TATA box。

2.2 表達載體的構建

鑒定正確的 U34-pMD18 simple用 NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收短片段，與雙酶切(AseⅠ和KpnⅠ酶)去除自身CMV病毒啟動子的pAcGFP1-N1載體長片段連接，構成表達載體，命名為U-GFP。因為酶切位點已經改變，所以只能進行PCR鑒定，如圖2所示，在700 bp左右擴增出特異條帶。

注:1:DL2000;2:PCR產物圖1 UHS啟動子PCR擴增Note:1.DL2000;2.PCR productsFig.1 The UHS promoter was amplified by RT-PCR

注:1:DL2000;2:U-GFP重組質粒PCR產物圖2 U-GFP的PCR鑒定Note:1.DL2000;2:PCR product of U-GFPFig.2 PCR identification of recombinant plasmid UGFP

注:1:PCR產物;2:MarkerⅢ圖3 U-β-gal的 PCR 鑒定Note:1.MarkerⅢ;2:PCR product of U-β-galFig.3 PCR identification of U-β-gal

注:1:Marker III;2:假陽性;3:酶切產物圖 4 U-β-gal的酶切鑒定Note:1.MarkerⅢ ;2:U-β-gal/BamHⅠ、NcoⅠFig.4 Identification of U-β-galby restriction endonuclease digestion

鑒定正確的 U12-pMD18 simple用 KpnⅠ和BglⅡ酶切，回收短片段，與用KpnⅠ和 BglⅡ雙酶切的pβgal-Basic長片段連接，構成表達載體，命名為UHS-β-gal。PCR得到了700 bp左右的片段(如圖3)。KpnⅠ和BglⅡ雙酶切檢測，得到約700 bp和約3000 bp的條帶(如圖4)，其與理論數值相符。

2.3 小鼠UHS啟動子的活性檢測

鑒定正確的U-GFP重組質粒轉染胎鼠皮膚組織塊24 h后，可以觀察到毛囊中GFP的表達。參見用UHS-β-gal轉染胎鼠皮膚組織塊，24 h后用試劑盒進行X-gal染色，并制作冰凍切片。對照組中未發現X-gal染色。轉染 U-β-gal重組質粒的皮膚塊中存在藍色點狀區域，即箭頭指示部位。見圖5～8(彩插6)。

3 討論

已 有 研 究報 道，KAP6［2］、Hox 基 因 Prox1［3］、FGF-2［4］和 KAP7-1［5］等基因在絨山羊不同發育時期的皮膚毛囊呈現特異的表達模式。另據Palmiter等［6］(1982)通過小鼠肝臟組織特異性啟動子和大鼠生長激素基因構建融合基因，并通過轉基因技術獲得“超級鼠”。已有大量的研究結果表明，在轉基因動物生產過程中，正確選擇啟動子是外源基因在特異組織表達的前提。上述結果為通過轉基因技術改變動物被毛特性提供了依據。

Powell等［7］(1997)的研究表明，毛發角蛋白基因(K2.9、K2.11、K2.10和 K2.12)僅在毛囊中處于分化中的角質化細胞中表達。K2.10角蛋白屬于低硫 II角蛋白，Bawden等［8］(1998)通過構建指導高效表達K2.10角蛋白的載體，并采用顯微注射法獲得了羊毛光澤和脆性發生改變的轉基因綿羊。另據Damak等［9］報道，利用小鼠超硫角蛋白啟動子區序列為前導區，可指導IGF1在轉基因綿羊表達而能提高羊毛產量。此外，王春生等［10］(2009)為了在綿羊被毛中表達擬蜘蛛絲蛋白基因，建立了轉pK2.10-擬蜘蛛絲蛋白基因綿羊成纖維細胞株。上述結果表明，選擇皮膚組織特異性啟動子可激活外源基因在皮膚中特異表達。

超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)是毛發特異的結構蛋白，屬于毛發角蛋白關聯蛋白(keratin associated proteins，KAP) 家族［11］。與動物體的其他蛋白相比，該蛋白家族含有最高的半胱氨酸且富含甘氨酸。與羊毛中超高硫角蛋白只占毛角蛋白組成的小部分不同，在小鼠和人類角蛋白中為主要組分。

為了建立在動物被毛中特異表達外源基因的方法，本研究選擇并克隆能夠在小鼠被毛中特異表達的小鼠超高硫角蛋白(UHS)啟動子(參見圖1)，將其連接pAcGFP1-N1載體分別構建了U-GFP(參見圖 2)和 U-β-gal表達載體(參見圖 3、4)，分別轉染胎鼠皮膚組織塊，檢測其表達活性。其結果，所構建U-GFP載體采用脂質體轉染法轉染小鼠皮膚成纖維細胞后，經24～48 h，在熒光顯微鏡下觀察到細胞中綠色熒光(參見圖 5、6)，表明啟動子 UHS可啟動GFP基因在小鼠成纖維細胞中具有表達活性;此外，當用 U-β-gal表達載體轉染胎數皮膚組織塊24 h后，利用試劑盒染色后，在可觀察到藍色的點狀區域(參見圖8)，表明 UHS啟動子可驅動 β-gal在皮膚塊細胞中特異表達。

綜上所述，本研究所克隆到的小鼠被毛特異表達的UHS啟動子，具有在胎鼠皮膚組織中表達的活性，如果將其與目的基因連接就有可能啟動外源基因在皮膚毛囊中特異表達，對此有待于進一步探討。

(本文圖5～8見彩插6。)

［1］ Dunn SM，Keough RA，Rogers GE，et al.Regulation of a hair follicle keratin intermediate filament gene promoter［J］.J Cell Sci，1998，111:3487－ 3496.

［2］ 張俊霞，王利，尹俊，等.KAP6基因家族成員在胚胎期山羊皮膚中的表達［J］. 畜牧與飼料科學，2009，(3):20－21，27.

［3］ 席海燕，尹俊，張燕軍，等.Hox基因Prox1在絨山羊皮膚中的表達［J］.中國草食動物，2006，(1):84－86.

［4］ 趙源，尹俊，張燕軍，等.絨山羊FGF-2結合蛋白基因在皮膚中的表達［J］. 中國草食動物，2006，(1):132－134.

［5］ 張俊霞，尹俊，李金泉，等.KAP7-1基因在內蒙古白絨山羊皮膚中的表達［J］. 中國草食動物，2006，(1):76－77.

［6］ Palmiter RD，Brinster RL，Hammer RE，et al.Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes.Nature，1982，300:611－ 615.

［7］ Powell BC，Rogers GE.The formation and structure of human hair［M］.Birkhuser Verlag，1997，59－ 148.

［8］ Bawden CS，Sivaprasad AV，Verma PJ et al.Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep:toward a new in vivo amino acid biosynthesis pathway and improved wool growth［J］.Transgenic Res，1995(2):87－ 104.

［9］ Damak S，Su H，Jay NP，et al.Improved wool production in transgenic sheep expressing insulin-like growth factor 1.Biotechnology(N Y)，1997，14(2):185－188.

［10］ 王春生，劉欣，原璐，等.轉 pK2.10-擬蜘蛛絲蛋白基因綿羊成纖維細胞細胞株的篩選［J］.畜牧獸醫學報，2009，40(8):1262－1265.

［11］ Aoki N，Ito K，Ito M.Isolation and characterization of mouse high-glycine/tyrosine proteins［J］.J Biol Chem，1997，272(48):30512－30518.

Cloning and Activity of Mouse Ultra-High Sulfur Keratin Gene Promoter

LI Hao1，WANG Chun-sheng1，NING Fang-yong1，2，Liang Yang1，PIAO Shan-hua1，AN Tie-zhu1
(1.College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

ObjectiveKeratin is the main structure albumen of the mammal wool，which is the most important part of the skin，hair and nail，etc.The aim of this study was to screen ultra-high sulfur keratin promoter in the hair follicles of mouse skin，and provide a basis for establishment of a transgenic technique for hair-specific expression of exogeneous protein.MethodsRegarding the genomic DNA from the mouse as a template，the mouse ultra-high sulfur keratin promoter(UHS)was cloned using molecular biologic methods，identified after conjugation with pMD18 simple vector and then insert it into pAcGFP-N1 plasmid，which had been excised the CMV promoter.After identification by PCR，a recombinant eukaryotic expression vector was constructed.At the same time，the promoter was linked to pβgal-basic，and recombination plasmid U-GFP and U-β-gal were obtained，respectively.The mouse skin tissue pieces were transfected by cationic liposomes of this plasmids.ResultsGFP expression was detected at mouse hair follicle region under blue light ilumination at 48 h after transfection，and the expression was decreased at 96 h after transfection.Moreover，at 48 h after transfection，blue dots of βgal staining were seen at the mouse hair follicle region.ConclusionThe UHS promoter is a tissue-specific promoter in the mouse hair follicles.

Ultra-high sulfur keratin;Promoter;Molecular cloning;Activity analysis;Mouse

圖5 藍光下轉染U-GFP的皮膚組織塊Fig.5 Skin piece transfected with U-GFP under blue light

圖6 藍光下對照組Fig.6 Skin piece of the control group

圖7 對照組冷凍切片Fig.7 A frozen section of the control group

圖8 轉染U-β-gal重組質粒的皮膚組織塊冷凍切片Fig.8 A frozen section of skin piece transfected with U-β-gal

R349.64

A

1005-4847(2010)06-0471-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.005

2010-06-22

國家自然科學基金資助(編號:30771538);東北林業大學引進人才科研啟動基金資助。

李昊(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:動物轉基因技術。0451-82191785。E-mail:jayhaoli01@126.com

安鐵洙，教授，博士生導師，E-mail:antiezhu@tom.com