慢性應激狀態下大鼠睪酮水平測定

劉占東，鮑曉力，張進祿，劉天會，趙煥英，趙君朋，陳珺，趙媛，趙紅，王得新

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經內科，北京 100050;2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病中心，北京 100050;3.首都醫科大學北京神經科學研究所，北京 100067)

慢性應激狀態下大鼠睪酮水平測定

劉占東1，鮑曉力2，張進祿3，劉天會2，趙煥英3，趙君朋3，陳珺1，趙媛1，趙紅1，王得新1

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經內科，北京 100050;2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病中心，北京 100050;3.首都醫科大學北京神經科學研究所，北京 100067)

目的 通過對于慢性應激模型和運動疲勞模型大鼠的血清睪酮水平的對比研究，探討慢性應激過程中睪酮水平變化規律及其與發生疲勞的關系。方法 建立大鼠慢性不可預測性應激模型及運動性疲勞模型;應用大鼠軌跡追蹤系統對不同應激時間大鼠進行活動量觀測，應用放射性免疫法對各組大鼠進行血清總睪酮和游離睪酮進行測定。結果 與正常組比較，慢性應激大鼠第1周組活動量(運動軌跡長度，下同)增加(P＜0.01)，第2周組活動量下降(P＜0.01)。各實驗組大鼠游離睪酮與總睪酮之間均存在線性相關。慢性應激各組隨應激時間延長，其游離睪酮與總睪酮比值呈逐漸下降趨勢，并且能夠達到運動疲勞組水平。結論 慢性應激條件可以明顯引起大鼠睪酮水平下降。提示分層檢測慢性疲勞綜合征人群血清總睪酮及游離睪酮的水平以及進行動態性研究可能為本病癥的診斷提供生化指標。以游離睪酮與總睪酮比值為指標檢測雄性激素水平，能夠更好地反映干預因素對動物生理上的影響。

慢性應激;疲勞;睪酮;慢性疲勞綜合征

應激是指內外環境劇變刺激時，機體出現的包括精神、神經、內分泌和免疫系統等的綜合應答狀態。強烈身心應激尤其是長期慢性應激嚴重影響著人類的身心健康，導致臨床疾病、亞健康狀態及早衰。目前認為慢性疲勞綜合征和抑郁癥的發生均與長期應激有關。

研究表明，在運動性疲勞過程中睪酮水平下降，睪酮水平與疲勞恢復程度存在相關性。動物實驗發現，懸吊、力竭性運動、高溫環境等均可出現大鼠睪酮水平降低。臨床研究發現，一些應用男性合成代謝類類固醇的人會表現出攻擊性行為，如精神錯亂、情緒紊亂、輕度躁狂、易怒和抑郁發作等。在性腺機能不良的患者中，睪酮替代療法可以明顯改善其情緒障礙和性行為;而長時間的睪酮替代能夠明顯的改善疲勞抑郁等陰性癥狀，最新研究表明低劑量的睪酮治療可以明顯改善女性抑郁癥患者的病情［1，2］。臨床上抑郁癥患者往往具有明顯的疲勞癥狀，以上證據表明，睪酮水平的變化與應激誘發的疲勞和抑郁等癥狀之間存在著密切的關系。

長效不可預測性溫和應激模型是目前常用的抑郁癥藥物篩選模型，它的主要設計思路是模仿人類社會經常面對的各種應激因素，通過不定順序的刺激方式使大鼠不能產生適應而進入疾病狀態。我們認為該模型的設計思路與近年國外大量研究的慢性疲勞綜合征的發病特點相符合。本研究的主要內容是通過對于慢性應激模型和運動疲勞模型大鼠的血清睪酮水平的對比研究，探討慢性應激過程中睪酮水平變化規律及其與疲勞發生的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

Wistar雄性大鼠，體質量200～250 g，來源于首都醫科大學實驗動物科學部【SCXK(京)2007－0001】。本研究獲得首都醫科大學倫理委員會批準。正常對照組，選取成年Wistar大鼠12只，正常飲食飲水，不給任何刺激，無需孤養。飼養3周后進行行為軌跡記錄，脫頸取血，－80℃冷凍保存。

1.2 應激動物模型及分組

選取成年Wistar大鼠48只;共分4組，每組12只，每只單籠飼養。各組動物分別在應激干預后7、14、21和28d進行行為軌跡記錄，每只記錄30 min后，脫頸取血，標本－80℃冷凍保存。按照改良Katz法進行不可預知應激刺激［3］，包括:4次24 h禁食，4次24 h斷水，4次24 h潮濕墊料(鼠盒中加水200 mL)，4次4℃冷水游泳5 min，4次45℃烤箱熱烘5 min，4次1 min夾尾，4次5 min高速水平振蕩。每天隨機給予一種刺激，共刺激28 d，每種刺激不得連續給予。

1.3 大鼠運動軌跡的記錄

采用清華大學醫學院神經工程研究所設計的大鼠軌跡追蹤系統，對正常對照組和慢性應激大鼠進行運動的距離進行量化描述。

1.4 大鼠運動性疲勞模型組

選取成年Wistar大鼠12只，飼養環境同正常大鼠組。

1.4.1 適應訓練:采用大鼠平板式運動疲勞儀(Panlab公司，LE8710)，每天訓練20 min，每周 5 d，共訓練5周。動物適應1～2 d后開始訓練，采用遞增強度的方式進行跑臺運動，坡度為0度。從訓練第1周起，每周遞增速度分別為 15、22、27、31和35 m/min。一般訓練:每周7 d，共2周。每只動物每日按35 m/min的速度，在坡度為0度的跑臺上跑20 min。

1.4.2 強化訓練:每周7 d，共1周。每只動物每日按35 m/min的速度，在坡度為0度的跑臺上跑30 min。最后1周改為每日按42 m/min的速度，在坡度為0度的跑臺上跑40 min。當最終大鼠處于運動疲勞狀態時，每只大鼠運動后喘息靜臥時間達到5 s以上。在完成最后一次運動之后，休息1 h。脫頸取血，標本－80℃冷凍保存［4］。

1.5 血清總睪酮和游離睪酮的測定

1.5.1 實驗儀器與試劑:DFM－96型10管放射放免γ計數器、睪酮放免試劑盒 Dsl－4000、游離睪酮放免試劑盒 Dsl－4900(Corporate Headquarrers，USA)，蒸餾水、恒溫水浴箱、微量加樣器等。

1.5.2 血清總睪酮的測定:按照睪酮和游離睪酮試劑盒操作步驟進行檢測。標準曲線的數學模型為logistic四參數擬合，測定時間60 s。總睪酮的標準曲線參數:相關系數 r=－0.9999，標準誤差 SD =998.080，Bo/T=39.01%;游離睪酮的標準曲線參數:相關系數 r=－0.9974，標準誤差 SD=17.565，Bo/T=39.99%。

2 結果

2.1 大鼠運動距離記錄結果

本實驗應用大鼠在30 min內的活動距離表示活動量，正常組和各應激組大鼠取材前運動軌跡結果分別為:正常組為(33.16±4.84)m，應激第1周組為(56.10±12.20)m，應激第 2周組為(24.03±4.93)m，應激第3周組為(27.39±5.76)m，應激第4周組為(34.12±6.73)m。應用 SPSS統計軟件，通過單因素方差分析發現與正常組比較，應激第1周組大鼠活動量明顯增加(P=0.000);第2周組大鼠活動量較正常明顯下降(P=0.005);第3周雖然活動距離比正常組仍縮短，但在統計學上不存在顯著性差異(P=0.073);而在應激第4周時大鼠的活動距離已經基本恢復到正常組水平(P=0.763)。

2.2 各組大鼠游離睪酮與總睪酮水平的相關性分析

應用SPSS統計軟件，通過各組大鼠游離睪酮與總睪酮水平的線性相關分析發現，二者之間存在高度的相關性，且各組相關系數的 P值均為0.000。其相關方程分別為:①正常組:總睪酮(ng/mL)=0.441×游離睪酮(pg/mL)+0.978，R2=0.966。②應激第1周組:總睪酮(ng/mL)=0.693×游離睪酮(pg/mL)－1.385，R2=0.959。③應激第 2周組:總睪酮(ng/mL)=0.568×游離睪酮(pg/mL)+0.049，R2=0.994。④應激第 3周組:總睪酮(ng/mL)=0.641×游離睪酮(pg/mL)－0.198，R2=0.988。⑤應激第 4周組:總睪酮(ng/mL)=0.589×游離睪酮(pg/mL)+0.134，R2=0.981。⑥運動疲勞組:總睪酮(ng/mL)=0.448×游離睪酮(pg/mL)+1.172，R2=0.952。

2.3 不同組大鼠睪酮水平

應用SPSS統計軟件，通過單因素方差分析發現，與正常組比較，應激第4周組總睪酮水平明顯下降(P=0.022);游離睪酮總體水平呈下降趨勢，其中應激第2周組和第4周組具有統計學差異(P值分別為0.029和0.008);以游離睪酮與總睪酮比值(FT/TT)作為統計量進行單因素方差分析，發現各組大鼠比正常組均出現下降。除應激第1周組外，其他各組均出現了統計學差異，其中應激第2周組為顯著性下降(P＜0.05)，其他各組均為非常顯著性下降(P＜0.01)。結果如表1所示，其中 A、B、C、D、E、F分別代表正常組、應激第1周組、應激第2周組、應激第3周組、應激第4周組和中樞性運動疲勞組。

表1 不同組大鼠睪酮(TT)和游離睪酮(FT)水平Tab.1 The testosterone(TT)and free testosterone(FT)levels in the rats of different groups

3 討論

本研究結果表明，運動疲勞模型大鼠的血睪酮和游離睪酮水平雖比正常大鼠降低，但未出現統計學差異，而游離睪酮與總睪酮的比值與正常組相比呈明顯下降(P＜0.01)。在慢性應激模型大鼠中，應激第4周組總睪酮和游離睪酮的水平均明顯降低，第2周組游離睪酮水平也明顯下降，但總睪酮未出現統計學差異。應激第3周組沒有出現統計學差異，可能與該組動物基礎睪酮水平偏高有關。本研究發現，各個實驗組的標準差均較大，說明不同大鼠間睪酮水平的個體差異較大。因此，如果單純以總睪酮和游離睪酮為指標進行研究則需要較大的樣本量。通過各組游離睪酮和總睪酮之間的線性回歸分析發現，二者存在很好的線性相關性，因而可以采用游離睪酮與總睪酮比值作為統計量進行分析。這樣既能夠很好消除不同大鼠之間睪酮水平的個體差異，又能夠直接反映出主要發揮功能的游離睪酮水平在總睪酮中所占比例的變化情況，因而能夠比較全面的反映出干預因素對于雄性激素水平變化的作用。Kuoppasalm［5］發現運動員在長跑和短跑時，血漿睪酮和類固醇結合球蛋白的比例不變，總睪酮和游離睪酮的變化始終是平行的。這與我們的研究結果相似。我們的結果表明，雖然大鼠在慢性應激的不同時間點其游離睪酮與總睪酮總是存在線性相關關系，但其斜率是不同的。隨著應激時間的不斷增加，大鼠游離睪酮與總睪酮的比值呈現逐漸下降的趨勢。到應激第3、4周時該值幾乎達到運動性疲勞組的水平。提示在運動和慢性應激條件下，大鼠游離睪酮水平的下降幅度較總睪酮大。

睪酮主要由睪丸的間質細胞合成，腎上腺皮質的網狀帶和卵巢也能分泌少量的睪酮。睪酮的主要作用是促進和維持第二性征，促進蛋白質的合成和組織的修復。在體內睪酮以結合和游離兩種狀態存在，大約60%的睪酮與性激素結合球蛋白結合，其余與白蛋白結合，而只有1% ～2%處于游離狀態。除游離睪酮外，與白蛋白結合的睪酮也可能具有生物活性，而性激素結合球蛋白則能夠抑制睪酮的活性。有研究發現長時間力竭性運動甚至可以使男運動員的血睪酮降至正常女性水平［6］。一次運動引起的血睪酮濃度下降可以很快恢復，一般為幾個小時或幾天。但如果長期高強度訓練，血睪酮較難恢復。因此，低睪酮水平與運動性疲勞狀態相關。最新的一項研究，表明在健康老年男性中，低游離睪酮水平提示體質比較脆弱［7］。本研究結果中慢性應激可以使大鼠體內睪酮水平的降低達到中樞性運動性時的水平。提示慢性應激可以導致大鼠長時間處于軀體疲勞狀態，并可能導致體質的下降。

本研究中不可預測慢性應激使大鼠的睪酮水平降低的原因可能為，在慢性應激條件下大鼠下丘腦－垂體－腎上腺(HPA)軸功能應激性亢進與下丘腦－垂體－性腺(HPG)軸功能應激降低密切相關。應激反應時，下丘腦促腎上腺皮質釋放激素(CRF)及腎上腺糖皮質激素(GCS)大量釋放，CRF和 GCS均可在下丘腦、垂體、性腺(睪丸或卵巢)多水平抑制 HPG軸功能［8－11］。最近研究發現，在加速衰老的大鼠模型中，其體內睪酮水平明顯降低，同時反映其活力指標的不活動的時間出現了明顯的延長［12］。52%的惡性腫瘤患者具有中－重度疲勞感，其中42.4%的女性和65.5%的男性脫氫表雄酮的水平偏低［13］這些證據說明睪酮水平與疲勞感之間存在著密切的關系。

到目前，雖然慢性疲勞綜合征病因和發病機制尚未闡明，但普遍認為其發病與長期應激相關。本研究中發現大鼠經慢性應激導致疲勞狀態時，其體內睪酮水平降低，這種改變以游離睪酮與總睪酮比值的形式變化最直接和可靠，能夠最大限度的避免個體差異。如我們將這一檢測手段用來研究長期處于高度應激狀況下人群的睪酮水平變化，則有可能尋找到診斷慢性疲勞綜合征的生物化學指標。

(致謝:清華大學醫學院神經工程研究所洪波老師，梁惠施同學;首都醫科大學化學生物學與藥學院李宇航老師;首都醫科大學實驗動物科學部喬欣老師在本研究中給予了大量幫助，在此表示真誠的感謝!)

［1］ O’ConnorDB， ArcherJ， HairWH， etal. Exogenous testosterone，aggression，and mood in eugonadal and hypogonadal men.Phys Behav［J］.2001，75:557－566.

［2］ MillerKK， PerlisRH， PapakostasGI， etal. Low－dose transdermal testosterone augmentation therapy improves depression severity in women.CNS Spectr［J］，2009，14(12):688－694.

［3］ 崔冬雪，范秦海，劉建國，等.游泳運動對實驗性抑郁癥大鼠行為學指標及皮質酮含量的影響.北京體育大學學報［J］，2007，30(1):38－40.

［4］ 李峰，楊維益，季紹良，等.運動性疲勞大鼠腦組織中一氧化氮合酶和內皮素mRNA表達的變化規律及中藥“體復康”的調節作用.中國運動醫學雜志［J］，2001，20:116－120.

［5］ Kuoppasalmi K.Plasma testosterone and sex－hormone－binding globulin capacity in physical exercise.Scand J Clin Lab Invest［J］.1980，40:411－418.

［6］ Aldlercreutz H ，H?rk?nen M，Kuoppasalmi K，et al.Effect of training on plasma anadolic and catabolic steroid hormones and their response during physical exercise.Int J Sporsts Med［J］，1986，7:27－28.

［7］ Hyde Z，Flicker L，Almeida OP，et al.Low free testosterone predicts frailty in older men:the health in men study.J Clin Endocrinol Metab［J］，2010 Apr 21.

［8］ Vervoorn C，Quist AM，Vermulst LT，et al.The behaviour of the plasma free testosterone/cortisol ratio during a season of elite rouing training.Int J Sports Med［J］，1991，12:257－263.

［9］ Kraemer WJ，Fleck SJ，Dziados JE，et al.Changes in hormonal concentrations after different heavy－resistance exercise protocols in women.Int J Sports Med［J］，1993，75(2):594－604.

［10］ Scave D， BarlettaC， VagiriD， etal. Adrenocoticotropic hormone，beta－endophin，cortisol，growth hormone and prolatin circulating levels in nineteen athletes before and after halfmarathon.J Sports Med Phys Fitness［J］，1991，31:401－406.

［11］ Urhancen A，Gabriel H，Kindermann W.Blood hormones as markers of training stress and overtraining.Sports Med ［J］，1995，20(4):251－276.

［12］ Egashira N，Koushi E，Okuno R，et al.Depression－like behavior and reduced plasma testosterone levelsin the senescenceaccelerated mouse.Behav Brain Res［J］.2010，209(1):142－147.

［13］ Shafqat A，Einhorn LH，N.Hanna N，et al.Screening studies for fatigue and laboratory correlates in cancer patients undergoing treatment.Ann Oncol［J］.2005，16:1545－1550.

Testosterone Level Decreases in Chronic Stress Rats

LIU Zhan－dong1，BAO Xiao－li2，ZHANG Jin－lu3，LIU Tian－hui2，ZHAO Huan－ying3，ZHAO Jun－peng3，CHEN Jun1，ZHAO Yuan1，ZHAO Hong1，WANG De－xin1
(1.Department of Neurology;2.Liver Research Center，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China;3.Beijing Institute for Neuroscience，Capital Medical University，Beijing，100067)

ObjectiveTo investigate the serum testosterone variation and its relevance to fatigue by a comparison of the serum testosterone levels in chronic stress rat model and athletic fatigue rat model.MethodsTo establish a chronic stress rat model and an athletic fatigue model，to monitor the rat activity capacity with a rat movement tracing device and to detect the serum total testosterone(TT)level and serous free testosterone(FT)level using radio－immunological methods.ResultsThe total activity capacity(referring to the length of rat movement track)of chronic stress rats increased(P＜0.01)compared with control in the first week.However，the chronic stress rats had lower total activity capacity than the control group(P＜0.01).The serum free testosterone(FT)level was linearly correlated with the total testosterone level in all groups.With the prolongation of stress，the FT/TT ratio in four week chronic stress group decreased to the same level in the athletic group.ConclusionChronic stress caused significant decrease in rat serum testosterone level，suggesting that it is applicable to quantify the biochemical parameters for the diagnosis of chronic fatigue syndrome(CFS)with dynamic tracing method and stratified evaluation of serum FT and TT in CFS patients.The FT/TT ratio proves to be a relaible indicator of male hormones，and may well reflect the physiological influence of interventional factors.

Chronic stress;Fatigue;Testosterone;Chronic fatigue syndrome;Rat

R872.7

A

1005－4847(2010)06－0526－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.017

2010－05－10

首都醫科大學基礎臨床合作課題 (編號:10JL33)。

劉占東(1971－)，男，醫學博士，副主任醫師。研究方向:神經系統常見疾病的神經生物化學領域，對于慢性疲勞綜合征有較為深入的研究。E－mail:Zhandongliu@hotmail.com