線粒體加工肽酶干擾 RNA真核表達載體的構建

張艷梅, 呼格吉樂, 馬飛煜, 鄔 偉, 馬翔凌

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是一種常見的神經系統變性病,其發生、發展機制涉及多基因表達改變[1]。盡管 PD的發病機制目前仍不完全清楚,但一些誘發因素在不同階段作用于不同基因,引起相關基因結構及表達水平改變而致病。MPPs的主要功能是特異識別一大類線粒體前體蛋白,并在單一和特定位點剪切這類蛋白,很可能與 PD有關[2]。在本研究的前期工作中利用蛋白組學技術對MPP+誘導的 PC12細胞 PD模型中發現線粒體加工肽酶(m itochondrial processing peptidases,MPPs)表達量變化顯著[3],因此本研究采用干擾 RNA技術特異性剔除或關閉 MPP+基因的表達,使培養細胞中的靶定基因沉默。因此本實驗針對 Pmpca基因,設計并構建 siRNA(small interference RNA,siRNA)表達載體,為進一步在體內外研究 MPPs的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細胞購自中科院上海細胞庫;AXYGEN質粒小量提取試劑盒購于杭州愛思進生物技術有限公司;BamH I、Bbs I購自 sigma公司;干擾 RNA的合成購自上海吉瑪公司;測序工作在上海 Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸的設計與合成

因國內外對 Pmpca-siRNA表達載體的構建,未見報道。本研究根據 Pmpca的所有變異體的共同序列設計出 shRNA,經 blast軟件進行同源搜索,確定其特異性。以下序列為 Pmpca部分 cDNA序列,黑體部分為靶序列即干擾部位。

shRNA模板中的 loop結構選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號,shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的 5'端添加了 CACC,與 BbsI酶切后形成的粘端互補;反義鏈模板的 5'端添加了GATC,與 BamHI酶切后形成的粘端互補;如果 siRNA的第一個堿基不是 G,則在 CACC后補加一個G,以下是以 SR-Pmpca-1425為例具體說明模板的設計。

1.2.2 shRNA模板的退火

將 DNA oligo分別用 TE(pH 8.0)溶解,濃度為100μmol/L。取相應的正義鏈和反義鏈 oligo溶液。退火條件：95℃ 5min;85℃ 5min;75℃ 5m in;70℃5min;4℃保存。退火處理后得到濃度為 10μM的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋 500倍,終濃度為 20nmol/L,用于連接反應。

1.2.3 PGPU6/GFP/Neo載體的線性化

圖1 PGPU6/GFP/Neo載體圖

取 2μg PGPU6/GFP/Neo載體進行酶切處理：37℃酶切1h,瓊脂糖電泳,使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)回收,電泳檢測估算濃度,稀釋濃度至 50ng/ul。

1.2.4 PGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構建

(1)載體的連接反應：22℃ 1h,轉到 JM109感受態細胞中。

(2)每個連接反應挑取 5個菌落,接種到含50μg/ml Kanamycin的 LB培養基中,37℃孵育過夜。挑取過夜培養平板上單個菌落置于 5ml含卡那霉素(30μg/m L)的 LB培養基中,37℃,250r/min振蕩培養12h。

(3)質粒提取：取 5m l在 LB培養基中培養過夜的菌液于離心管中,室溫 11200r/min離心 1min,棄盡上清;用 250μl已加入 RNase A的 Buffer S1懸浮細菌沉淀,加入 250μl Buffer S2,翻轉混合 4～6次,混合均勻,使菌體充分裂解,形成透亮的溶液。加入350μl Buffer S3,翻轉混合 6～8次,11200r/min離心10min;吸取離心上清并轉移到 DNA制備管中,11200r/min離心 1m in,棄濾液;將制備管置回離心管 ,加 500μl BufferW1,11200r/min離心 1min,棄濾液;將制備管置回離心管,加 700μl Buffer W2,11200r/min離心 1m in,棄濾液;以同樣的方法再用700μl BufferW 2洗滌 1次。確認在 Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇;將制備管置回 2m l離心管中,11200r/min離心1min;將制備管移入新的 1.5ml離心管中,在 DNA制備管膜中央加 60～80μl Eluent或去離子水,室溫靜置 1min。 11200r/m in離心 1min。將 Eluent或去離子水加熱至 65℃將提高洗脫效率;使用堿裂解法抽提質粒,所得質粒用 Bam H I,Pst I分別酶切鑒定(見圖2、圖3),測序鑒定。

2 結 果

2.1 質粒酶切

使用堿裂解法抽提質粒,所得質粒用 Bam H I,Pst I分別酶切鑒定,陽性重組載體應該可以被BamH I切開,而不能被 Pst I切開。酶切結果表明,所有質粒均為陽性重組載體(見圖2、圖3)。

2.2 測序鑒定

每組選擇兩個克隆進行測序鑒定。構建的 siRNAs序列與基因庫中序列完全相同,并且未發現有突變、缺失、插入等異常存在。

圖2 重組載體的酶切鑒定

圖3 重組載體的酶切鑒定

3 討 論

RNAi技術的基本原理是將雙鏈 RNA(doublestranded RNA,dsRNA)裂解為 21～25個核苷酸組成的 siRNA作為介導子,引起同源序列特異性的 mRNA降解[4]。siRNA是 RNA干擾過程中的重要中間分子。體外制備的方法包括直接化學合成或利用Dicer或 RNA酶Ⅲ消化長的 dsRNA,也可利用質粒和病毒載體構建載體在細胞內表達[5]。RNAi技術近年來發展迅速,已成為分子生物學研究的主要技術手段之一,如 siRNA脂質體介導法[6],抑制艾滋病病毒[7,8]癌癥的早期發現[9]等,已逐漸被應用于人類基因功能研究和基因治療方面。當然,開發這類RNAi治療需要花費幾年甚至更長的時間,但隨著研究的不斷深入將會有更多以 RNAi機制為基礎的治療手段被用于臨床[10]。

線粒體加工肽酶(mitochond rial processing peptidases,MPPs)是一種金屬內切蛋白酶[11],它也是由 α和 β兩個亞單位組成的可溶性的異源二聚體,分子量是 100～110kD。MPPs的主要功能是特異識別一大類線粒體前體蛋白,并在單一和特定位點剪切這類蛋白。目前關于 MPPs與神經系統變性病的研究開展很少,但從上述研究中可以看出,MPPs與神經變性病的發生有著一定的聯系,但在國內外 PD研究的相關文獻中未見該蛋白的報道。張艷梅等[3]研究首次發現 MPPs蛋白在 PD的發病中可能起一定的作用,值得深入研究以闡明其詳盡的作用機制。

本研究通過構建 shRNA的真核表達載體,旨在為帕金森病的基因治療提供一種有效手段。MPPs真核表達載體的構建未見報道。本研究根據該基因的所有變異體的共同序列設計出 shRNA,經 blast軟件進行同源搜索,確定其特異性,模板為含有靶點序列回文結構,這樣細胞內合成的 RNA為發夾樣雙鏈結構,可產生分子內莖-環結構,被內源性 Dicer酶處理成 21nt的雙鏈 siRNA,發揮 siRNA的效應,達到特異性抑制靶基因表達的目的。再用 PAGE方式純化,確定其準確性。通過與真核表達載體PGPU6/GFP/Neo連接,酶切鑒定和基因測序證明 MPPs特異性 siRNA真核表達載體 PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-1113、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-1425、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-561、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-903構建成功。

綜上所述,本實驗為進一步研究 MPPs基因功能缺陷對 PC12細胞的侵襲、增值的影響,以及雙向電泳探究基因功能缺陷后蛋白的表達奠定了基礎。

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