GM-CSF在兔動脈粥硬化非梗死模型顱內血管生成中的作用及其機制的探討

王 巖, 張桂運, 陳左權

近年來諸多研究證實,粒/巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)可誘導大量側支循環建立,并有望成為那些不適合手術或介入治療的廣泛微小動脈狹窄的缺血性心血管疾病患者的治療選擇之一[1]。

但此類研究在缺血性腦血管疾病的應用方面涉及較少。我們在既往的實驗中,嘗試將兔動脈粥樣硬化模型右側鎖骨下動脈椎動脈開口近端結扎,在盡可能地模擬人類動脈粥樣硬化的情況下,逐漸出現腦血液循環低灌注的動態病理生理過程。

在此模型基礎上,本科題組研究證實了 GMCSF可以顯著促進該模型腦組織缺血敏感區(前、后分水嶺區域)血管生成[2],但尚未對 GM-CSF治療后腦血液循環狀態及顱內血管功能變化進行深入的評估。

在研究中,我們就 GM-CSF誘導顱內血管生成后,GM-CSF是否改善全腦血液循環狀態以及 GMCSF誘導顱內血管生成可能的調節機制進行初步探討,為探索一種可行的預防性治療缺血性腦血管疾病的方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只雄性新西蘭大白兔(體重 2.0～3.0Kg,由同濟大學附屬同濟醫院動物實驗中心提供)。隨機分為對照組 (ctr)、動脈粥樣硬化組(AS)、生理鹽水治療組(NS)、GM-CSF治療手術模型組(GM-CSF),每組 10只。ctr組喂以基礎飼料(普通顆粒飼料,自由飲水);余 3組均喂以高脂飼料(1%膽固醇 +5%豬油 +5%蛋黃粉 +89%基礎飼料)。第 12周,各組均接受開胸并結扎右側鎖骨下動脈椎動脈開口近端。各組動物術后均給予肌肉注射頭孢替胺,每天一次,每日0.5g,連續 3d。GMCSF組給予皮下注射 GM-CSF,劑量為 40μg/kg-1,qd alt,共 3w;NS組皮下注射等體積的生理鹽水,隔日一次,共 3w。ctr、AS組不予任何治療。造模后,每組隨機抽取 2只,行 DSA及頸動脈血管病理學檢查,證實造模成功。

1.2 藥物、儀器與試劑 GM-CSF購于廈門特保生物工程股份有限公司;雙 C臂三維數字血管造影機(DSA)由美國 GE公司生產;Western Blot儀器由美國伯樂公司生產;腦血管血液動力學檢測儀(CV-300)由上海麥登電子設備有限公司生產。

1.3 腦血管 CVHI檢測方法 30%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(1ml/kg)成功后,切開皮膚,充分暴露雙側頸動脈,一側插管,接換能器,進行血壓監測;另一側使用 CV-300多普勒超聲探頭檢測頸動脈血液流速。系統根據超聲探頭及壓力傳感器測定的流速及壓力數值,自動計算出各組相應的CVHI值。

1.4 Western Blot分析 提取腦組織蛋白,Bradford法測定濃度。按照計算的蛋白量加樣后電泳。10%的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)作為分離膠。濕轉法轉移至硝酸纖維素(PVDF)膜上,用 5%的脫脂牛奶封閉 2h。加入新鮮 PEDF或VEGF一抗((Santa Cruz Biotechnology,USA),4℃孵育過夜。次日取 PVDF膜,TBST洗滌 3次。加入二抗(Santa Cruz Biotechnology,USA),室溫孵育 1h。TBST洗滌 3次,加 ECL發光底物,暗室曝光、定影、晾干。利用 Gel-Pro軟件進行密度掃描定量分析。

1.5 數據統計分析 所有數據應用 SPSS15.0統計軟件處理,結果以均值 ±標準差(±s)表示。各組間均數比較采用單因素方差分析。以 P＜0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兔腦血管 CVHI檢測 AS及 NS組雙側頸動脈 Vmin較 ctr組明顯減慢(P＜0.01),Vmax各組間無顯著性差異(P＞0.05),Wv和 Rv值顯著升高(P＜0.01);AS與 NS組之間 CVHI無明顯差異(P＞0.05);GM-CSF組較 AS及 NS組的頸動脈Vmin顯著增快(P＜0.01),Vmax各組間無顯著性差異(P＞0.05)。同時,Wv及 Rv值較 AS及 NS組低(P＜0.01)(見表1)。

2.2 GM-CSF對兔腦組織缺血敏感區域 PEDF及 VEGF蛋白表達影響

2.2.1 前分水嶺區域腦組織 PEDF及 VEGF蛋白表達 Western blot分析顯示,AS組、NS組前分水嶺區域腦組織的PEDF及VEGF蛋白表達較ctr組均有增加(P＜0.05);AS組與 NS組之間的 PEDF蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05);GM-CSF組PEDF蛋白表達較其它各組降低顯著(P＜0.01),但仍高于 ctr組(P＜0.01)。但是,AS、NS及 GM-CSF組之間的 VEGF蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)(見圖1A、圖1B)。

2.2.2 后分水嶺區域腦組織 PEDF及 VEGF蛋白表達的變化 Western blot分析顯示,AS組、NS組后分水嶺區域腦組織的 PEDF及 VEGF蛋白表達較 ctr組明顯增加(P＜0.01);AS組與 NS組之間的PEDF、VEGF蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05);而GM-CSF組 PEDF蛋白表達較 AS及 NS組顯著降低(P＜0.01),但仍高于 ctr組(P＜0.01)。同時,GMCSF組 VEGF蛋白表達較其它 3組呈升高趨勢,且有統計學差異(P＜0.01)(見圖2 A、圖2B)。

表1 各組頸動脈系統腦血管血液動力指標(CVH I)變化(±s)

表1 各組頸動脈系統腦血管血液動力指標(CVH I)變化(±s)

與正常對照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數：8組)

組別Vmax(cm/s)

圖1 A 各組前分水嶺區域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達,編號 1～4依次為ctr組、AS組、NS組、GM-CSF組。圖1B 各組前分水嶺區域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達定量分析,與正常對照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數：5組)

圖2 A 各組后分水嶺區域腦組織 PEDF及 VEGF因子蛋白表達,編號 1～4依次為ctr組、AS組、NS組、GM-CSF組。圖2B 各組后分水嶺區域腦組織 PEDF及VEGF因子蛋白表達定量分析,與正常對照組相比*P＜0.05,**P＜0.01;與動脈粥樣硬化模型組相比#P＜0.05,##P＜0.01(組數：5組)

3 討 論

眾所周知,腦分水嶺區是指大腦的兩條主要動脈分布區的交界處。當動脈粥樣硬化所致腦供血不足時,這些部位最易并且最早出現缺血、缺氧等病理生理性改變。在這些腦缺血的敏感區域觀察到 GM-CSF具有誘導血管生成的生物學效應,對于腦缺血的預防性治療具有非常重要的指導意義。然而,雖然我們前期實驗中證實了 GM-CSF治療誘導腦組織缺血敏感區血管生成,但是這些新生成的血管是否能夠改善全腦血液循環狀態尚未進行評估。

在本實驗中,我們利用 CV-300血液動力學檢測儀對各組兔的 CVHI進行檢測。檢測指標包括：頸動脈最大血流速度(Vmax)、最小血流速度(Vmin)、脈搏波波速(Wv)、腦血管外周阻力(Rv)等。大量臨床和動物實驗研究表明,CVHI的異常變化與缺血性腦血管疾病的發生與發展有著密切聯系,其異常變化往往早于影像學改變。在血液動力學諸指標中,Vmin是反映腦血管損害最為敏感的指標,與卒中發病風險關系最為密切[3]。而 Wv是反映動脈彈性較為敏感的指標;Rv則是反映中、小血管(直徑 20～400μm)通暢程度的最具代表性的定量指標。當動脈粥樣硬化時,Wv和 Rv這兩個指標將會出現不可逆的持續性增高[4]。而且,前瞻性隊列研究表明,兩者與卒中發生的風險也有密切關系[5]。通過以上參數的測定,不僅可以評估腦血管血液循環的狀態,而且在一定程度上可以反映腦血管的生理功能情況。

通過比較各組 CVHI發現,AS及 NS組雙側頸動脈Vmin較ctr組明顯減慢,Wv和Rv值顯著升高。這說明非治療組兔腦血管功能降低,同時顱內中、小血管通暢程度明顯下降,血管床的血流阻力增加;而GM-CSF治療組兔頸動脈 Vmin較 AS及 NS組顯著增快,同時 Wv及 Rv值較 AS及 NS組低。這提示我們,預防性的皮下注射 GM-CSF誘導生成的血管,可以預先建立良好的側支循環網絡,通過改善小血管通暢程度、降低血管床阻力、發揮改善全腦血液循環狀態的作用。這一結論與國內外報道基本一致[6,7]。

另外,對于 GM-CSF促進血管生成,誘導側枝循環建立的機制問題,目前說法不一。近年來,在血管生成的調控機制上,Hanahan和 Folk-man等提出了“血管生成平衡學說”,即血管的病理生理變化主要取決于血管生成誘導因子和抑制因子之間的平衡,一旦此平衡打破,就會激活血管系統向某一狀態失衡,進而誘導血管生成或抑制血管生成平衡系統使血管壁重構,最終導致血管的病理性改變[8]。目前,這一理論被國內外學術界所公認。根據此理論,我們可以推測：不論 GM-CSF誘導血管生成通過何種途徑發揮效應,最終都要影響和干預血管生成系統中的相關因子的平衡才得以實現。而在參與此調節的諸多影響因子中,PEDF及 VEGF是血管生成調控的兩大關鍵因子,兩者動態的平衡在血管生成調節過程中起著非常重要的作用。VEGF是主要的血管生成誘導因子,其主要的生理作用就是特異性促進血管內皮細胞增生、遷移和血管生成。PEDF則具有極強的抑制血管生成的生物學效應[9,10]。

雖然目前尚無 GM-CSF影響 VEGF及 PEDF因子的表達水平,并進而干預血管生成系統平衡的直接證據,但是從我們的實驗數據來看,GM-CSF治療組的前、后分水嶺區域腦組織 PEDF蛋白表達較動脈粥樣硬化組及生理鹽水組低很多,這提示我們GM-CSF很可能抑制了模型組兔腦組織的 PEDF表達。而對于 GM-CSF與 VEGF兩者之間的相互作用關系,結果顯示,GM-CSF治療組的前、后分水嶺區腦組織 VEGF蛋白的表達均略高于未治療組。雖然在前分水嶺區腦組織樣本中,GM-CSF治療組與 AS組及 NS組之間無顯著性差異,但就總的趨勢而言,GM-CSF治療后,前、后分水嶺區域腦組織的 VEGF蛋白表達水平確實呈持續增高趨勢。

總之,以上的研究證實了預防性的皮下注射GM-CSF能夠誘導血管的生成,并可以預先建立良好的側支循環網絡,進而可以改善腦組織的血液循環。這一結論與國內外報道基本一致。同時,根據我們的實驗結果推測：GM-CSF抑制了動脈粥樣硬化腦組織的 PEDF因子表達;而對另一種促進血管再生的因子 VEGF,則可能起到了直接或間接上調的作用。這將會使腦組織中抑制血管生成的能力得到減弱,而促進血管生成的能力得到增強,進而發揮促進血管生成的作用。

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