聲動力化學療法促大鼠腦膠質瘤細胞凋亡及抗血管作用的實驗研究

2010-09-20 08:03:36宋大勇林述凱李建華

中風與神經疾病雜志 2010年12期

關鍵詞：意義

宋大勇, 岳武, 魏盾, 林述凱, 孫超, 李建華

聲動力化學療法(sonodynamic therpy,SDT)可引起體外大鼠 C6膠質瘤細胞凋亡[1],為進一步觀察 SDT對大鼠腦膠質瘤細胞凋亡的影響及是否有抗血管因素參與,我們以大鼠顱內 C6膠質瘤為模型,研究了 SDT處理后大鼠腦膠質瘤的細胞凋亡與微血管蛋白表達的變化。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑大鼠 C6膠質瘤細胞(哈爾濱醫科大學神經外科研究所)、Wistar大鼠(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心)、HMME(北京英發康美技術開發有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI-1640培養液 (美國 Hylone公司)、胰蛋白酶(美國 AMRESCO公司)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(寶靈曼公司)、兔抗鼠 VEGF、CD34免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔IgG免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物制品有限公司)、SABC試劑盒通用型(Zymed公司)、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物制品有限公司)。

1.2 儀器 US天使多功能治療儀(天使科技控股有限公司)、大鼠腦立體定向儀(上海江灣Ⅱ型)、MIR機(日本東芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差顯微鏡(日本 OLYMPUS公司 IX70型)、CO2培養箱(上海 Heraeus公司 BB5060型)、潔凈操作臺(上海力申科學儀器有限公司 H fsate1200型)、離心機(上海安亭科學儀器廠 80-2B型)。

1.3 方法

1.3.1 C6膠質瘤細胞培養 C6膠質瘤細胞接種于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640完全培養液25ml培養瓶中,將培養瓶置于 37℃、5%CO2和 95%空氣的培養箱中常規培養,待細胞處于對數生長期時實驗。

1.3.2 大鼠 C6腦膠質瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,體重 250～350g)96只。術前 12h禁食、禁水,1%戊巴比妥鈉按 40mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江灣Ⅱ型立體定向儀上,常規方法制作大鼠顱內 C6腦膠質瘤模型[2]。術后連續 3d注射青霉素 4萬 U/d,常規飼養。

1.3.3 實驗分組大鼠接種 C6膠質瘤術后14d,經 MIR掃描,待腫瘤直徑達 3～5mm隨機分成4組：(A)SDT組,即 US加 HMME組;(B)單純超聲(US)組;(C)單用血啉甲醚(HMME)組;(D)未處理的對照組。每組 24只。

1.3.4 SDT處理 1%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)后,A、C組大鼠尾靜脈注射 HMME(10mg/kg),2h后 A、B組行 US照射(頻率：1.0mHz,聲強度：0.5W/cm2,時間：120s)。處理后的大鼠避光 7d,常規飼養。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般狀態切口愈合情況、活動能力、體重變化、有無偏癱、抽搐等神經功能缺失癥狀。

1.4.2 原位細胞凋亡檢測 4組大鼠處理后24h、3d,7d分別隨機處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標本常規固定、包埋、切片。TUNNEL法檢測細胞凋亡情況,方法按照 Roche公司原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,常規封片,顯微鏡下觀察。以核陽性為判定標準,并結合 HE染色 40倍顯微鏡下觀察,對 HE染色證實為壞死的細胞不記數。細胞核內有棕褐色染色者為陽性細胞,400倍顯微鏡下每張切片隨機選擇 5個視野,兩人雙盲計數 500個細胞中的陽性細胞數,取均值。排除有嚴重的炎癥反應和壞死灶的區域,因為這給單個凋亡細胞的鑒別帶來困難。計算凋亡細胞百分率：凋亡細胞百分率(%)=陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)×100%。

1.4.3 VEGF蛋白、CD34蛋白表達水平觀察4組大鼠治療 24h、3d、7d后,分別隨機處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標本常規固定、包埋、切片。標本免疫組織化學染色采用 SABC法,按說明書進行操作。因 CD34蛋白主要表達于血管內皮細胞,在間質和癌巢都有分布,MV形態表現為管狀、線狀和點狀,以一個或一組內皮細胞標記為一條血管,故通過測定 CD34蛋白表達可判定 MVD結果：先在 40倍光鏡下掃視腫瘤區域,選擇血管豐富的區域,轉400倍顯微鏡下觀察,隨機選擇 5個視野,記數被抗CD34抗體染成棕色的 MV數目,取均值作為該例的MVD值。VEGF蛋白表達結果判定：先在 40倍光鏡下掃視腫瘤區域,選擇 VEGF蛋白表達較強的區域,400倍顯微鏡下觀察,隨機選擇 5個視野,兩人雙盲計數 500個細胞中的陽性細胞數(細胞胞漿內棕褐色染色),取均值。VEGF蛋白表達率計算公式同前。對 4組各時間點 MVD值、VEGF蛋白表達分別與凋亡率計算 r值。

2 結果

2.1 一般狀態在實驗過程中因操作不慎死亡或腫瘤失敗的大鼠予以重新補充。大鼠接種后均無感染,從接種后第 3天開始,部分大鼠逐漸出現消瘦、肢活動不靈活、抽搐、易激惹等表現,瀕死前 4組均表現頻發抽搐、極度消瘦、惡液質等癥狀。

2.2 原位細胞凋亡檢測結果檢測結果(見表1,見圖1、圖2)。HMME組和對照組凋亡細胞極少,各時間點凋亡率比較,無統計學意義。切片均未見明顯壞死細胞,偶見凋亡細胞。US組處理后 24h,切片可見小片狀壞死區和散在分布的壞死細胞,凋亡細胞散在分布,凋亡率高于 HMME組和對照組,有統計學意義;處理后 3d切片可見散在壞死細胞,偶見凋亡細胞,凋亡率較處理后 24h下降,與 HMME組和對照組比較,無統計學意義;處理后 7d,切片未見明顯壞死細胞,偶見凋亡細胞,凋亡率與 HMME組和對照組比較,無統計學意義。SDT組處理后24h,切片可見明顯片狀壞死區或壞死細胞,凋亡細胞多分布于片狀壞死區周邊,或與壞死細胞夾雜,凋亡率明顯高于其它 3組,有統計學意義;處理后 3d,切片見片狀壞死區明顯縮小、壞死細胞數量明顯減少,凋亡細胞少見,但凋亡率與其它 3組比較,仍有統計學意義;處理后 7d,切片未見壞死細胞,凋亡細胞偶見,凋亡率與其它 3組比較,無統計學意義。

2.3 MVD、VEGF蛋白表達結果結果(見表2、表3,見圖3～圖6)。HMME組和對照組各時間點MVD、VEGF蛋白表達比較,無統計學意義。2項染色在瘤組織內分布不均勻,瘤組織與正常腦組織交界區表達相對較強。切片均未見明顯壞死細胞。US組處理后 24h,MVD、VEGF蛋白表達與 HMME組和對照組比較,略下降,無統計學意義,切片可見小片狀壞死區和散在分布的壞死細胞;處理后 3d,2項表達結果與HMME組和對照組類似,無統計學意義,切片可見散在壞死細胞;處理后 7d,2項表達結果與 HMME組和對照組類似,無統計學意義,切片未見明顯壞死細胞。SDT組處理后 24h MVD、VEGF蛋白表達與其它3組比較,明顯下降,有統計學差異,切片可見明顯片狀壞死區或壞死細胞;處理后 3d,二者表達有所升高,但仍較其它3組低,與其它 3組比較,有統計學意義,切片見片狀壞死區明顯縮小、壞死細胞數量明顯減少;處理后 7d,除MVD結果與HMME組比較有統計學意義(P=0.0496)外,MVD與 US或對照組比較,無統計學意義。VEGF表達率與其它 3組類似,無統計學意義,切片未見明顯壞死細胞。SDT組和 US組 MVD密度較高、VEGF蛋白表達較強的區域壞死細胞分布較少。SDT組 MVD與凋亡率的 r=-0.81(P＜0.01);VEGF蛋白表達率與凋亡率的 r=-0.93(P＜0.01)。

表1 4組大鼠凋亡率(%)的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.01;與對照組比較*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT組US組HMME組對照組25.10±0.82*6.28±0.68△*0.30±0.30△0.43±0.38△1.23±0.54*0.35±0.40△0.18±0.23△0.38±0.36△0.23±0.23 0.13±0.28 0.28±0.51 0.23±0.29

表2 4組大鼠 MVD的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.05,△△P＜0.01;與對照組比較*P＜0.01

24h 3d 7d SDT組US組HMME組對照組27.88±1.15*71.28±1.34△△71.65±1.25△△72.08±1.46△△44.15±1.01*74.05±1.23△△74.28±1.05△△73.70±1.68△△71.33±1.18 71.35±1.13 72.58±1.04△71.93±1.37

表3 4組大鼠 VEGF蛋白表達率(%)的比較(±s,n=8)

與 SDT組比較△P＜0.01;與對照組比較*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT組US組HMME組對照組8.98±0.59*45.83±2.28△46.00±1.92△47.20±1.27△35.83±1.28*47.90±1.32△47.08±0.85△47.25±2.01△46.98±0.81 46.45±1.54 46.83±0.59 47.10±1.28

3 討論

惡性膠質瘤有豐富的異常血管,內皮細胞的活化和增生是腫瘤血管生成的前提,在膠質瘤微環境中,腫瘤細胞產生的各種促血管生長因子作用的主要靶細胞亦是內皮細胞,而 VEGF是膠質瘤血管生成的主要調節因子,膠質瘤新生毛細血管的密度與膠質瘤產生的 VEGF表達量呈正相關[3]。VEGF分子量為 34～46kD,是多肽血管生長因子,膠質瘤細胞分泌的 VEGF通過旁分泌方式作用于血管內皮受體,經酪氨酸激酶傳導通路發揮功效。VEGF功能是：(1)增加 MV通透性,促進血漿纖維蛋白外滲,為血管生成過程中多種細胞遷移提供了纖維網絡;(2)通過與內皮細胞上兩個 VEGF受體 Flt1(fms樣酪氨酸激酶)和 flk(胎肝激酶)作用,直接刺激內皮細胞增殖,并產生纖維蛋白溶解酶原激活劑(組織型和尿激酶型)和膠原酶等。這不僅可促進內皮細胞移位,有利于血管生成,而且還有利于腫瘤細胞脫落進入血管或向鄰近纖維蛋白和結締組織基質擴散,為腫瘤的浸潤和轉移創造了條件。2003年李永利的研究表明[4],應用 VEGF抗體不但可抑制大鼠 C6膠質瘤的血管形成及腫瘤生長,還可誘導腫瘤細胞凋亡。

研究已經證實 SDT可引起體外 C6膠質瘤細胞凋亡[1],通過原位細胞凋亡檢查,發現大鼠顱內膠質瘤在 SDT處理后早期(24h)腫瘤組織凋亡達到高峰,隨后凋亡的瘤細胞均逐漸減少,至處理后 7d時腫瘤組織中已見不到凋亡的瘤細胞,這表明凋亡是SDT殺傷膠質瘤的重要方式,凋亡高峰出現于處理后早期(24h),但凋亡時間較體外(6h)略后移,這可能因為 US作用于體外細胞時衰減低,而作用于顱腦組織中衰減增強,與較低的聲強度啟動細胞凋亡時間較長有關。24h后細胞凋亡明顯減少,處理后 7d,4組凋亡率已無統計學意義,表明 SDT僅在處理后24h內對細胞凋亡存在明顯影響,而中遠期則無影響。US處理后也可引起膠質瘤細胞凋亡,其高峰同樣發生在早期(24h),但腫瘤細胞凋亡率明顯較 SDT低,提示,凋亡也是 US殺傷體內膠質瘤的方式之一。單用 HMME未顯示出對細胞凋亡有影響。

我們觀察了 4組大鼠顱內膠質瘤 MVD、VEGF的變化,結果表明,SDT處理后極早期(24h)MVD及VEGF表達明顯下降,處理后早期(3d)MVD及 VEGF表達有所上升,但仍較其它 3組低,直至處理后中期(7d)VEGF表達才恢復正常。MVD與 HMME組比較,雖有統計學意義,但 P=0.0496,結果尚需具體分析。這提示 SDT對體內膠質瘤殺傷有明顯的血管靶向作用。SDT處理后 MVD及 VEGF表達結果與凋亡率成負相關(P＜0.01),提示 SDT可通過損傷血管、抑制腫瘤的血管形成、造成腫瘤細胞缺血、缺氧,從而引起腫瘤細胞中低氧誘導因子-1(HIF-1)表達增加,通過bcl-2途徑誘導膠質瘤細胞凋亡[4]。單用 US和單用HMME后 MVD及 VEGF表達強度與對照組無明顯差異,提示US和 HMME無血管靶向作用,US的抑瘤效應可能與血管靶向作用無關。