骨髓間充質干細胞移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調節蛋白激酶的影響

郭繼東, 王 月, 信 宏

目前關于臨床上治療缺血性腦卒中的方法有早期溶栓、保護腦細胞及抗血小板聚集等方法,有效的治療措施只有極早期的溶栓治療,但是很少有患者受益。近年發現骨髓間充質干細胞(BMCs)可以分化為神經細胞[1],使其成為治療缺血性腦卒中研究的熱點。關于其機制的研究較多的集中于各類生長因子及營養因子,而對于信號轉導系統方面未見報道。故本研究欲觀察 BMCs移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)的影響。

1 資料與方法

1.1 動物與試劑 健康幼年Wistar大鼠 5只,體重(120±10)g,用于提取 BMCs;健康成年Wistar大鼠 30只,體重(300±10)g,用于制作缺血性腦卒中模型。所有大鼠均雌雄不限,且由吉林大學實驗動物中心提供。DMEM培養基、胎牛血清購自 Sigma公司,大鼠腦立體定位儀購自北京智鼠多寶公司;ERK免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 MSCs的分離、培養及收集 聯合采用密度梯度離心及貼壁法分離培養大鼠 MSCs,原代培養達 80%以上融合后按 1∶3傳代培養,選取生長良好的 1、2、3代細胞,用 0.25%胰蛋白酶室溫消化 5m in,用含胎牛血清的培養液終止消化,PBS清洗,1000r/min離心,每次 5min,共離心 3次,然后收集培養的大鼠 MSCs用于移植。

1.2.2 大鼠分組及缺血性腦卒中模型制作 30只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組和 BMCs移植組,每組10只。采用Longa[2]方法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。麻醉清醒后 2h采用Longa[2]的評分方法進行評分。0分和 4分的動物棄之不用。假手術組只行開顱術,不凝閉大腦中動脈。

1.2.3 MSCs的移植 于造模術后 1w行細胞移植實驗。在腦梗死側(右側)殼核區于立體定向儀定位下進行直接注射移植。移植組注射MSCs懸液 5μl,其他兩組大鼠于相同部位注射同等量不含細胞的0.1mol/L PBS。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能損傷程度評分(NSS) 分別于造模前、移植前及移植后第 4周對各組動物進行NSS,評分標準參考Chen等[3]方法,主要觀察運動、感覺功能、平衡能力及生理反射能力;總分為 18分,正常為 0分,分值越高其神經損害程度越嚴重。

1.3.2 免疫組化染色 移植后第4周,每組取5只處死大鼠取腦組織。腦組織用生理鹽水和多聚甲醛先后經心灌注固定,石蠟包埋,冠狀切片。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作進行腦組織免疫組化染色檢測ERK蛋白表達。顯微鏡下任選 5個 400倍視野計數陽性細胞。

1.3.3 腦梗死體積檢測 移植后第 4周,各組剩余大鼠處死,取腦,于 -20℃冷凍 20min,冠狀切片,由前到后,共 5張切片,置 2%TTC液中,37℃避光孵育 30m in,梗死區不著色,正常腦組織染成紅色,隨即采用 40g/L甲醛固定,根據蒼白區觀察梗死灶范圍,依據公式計算梗死面積[4]。

1.4 統計學方法 實驗數據以均數 ±標準差表示,應用 SPSS 13.0進行方差分析和 t檢驗。

2 結 果

2.1 實驗動物數量統計 假手術組無動物缺失,模型組因麻醉過量死亡 2只,BMCs移植組因術后感染死亡 1只,其余大鼠均進入結果統計。

2.2 各組動物NSS 造模前各組動物 NSS比較無顯著差異(P＞0.05);移植前,模型組及移植組 NSS評分均較假手術組增高明顯(P＜0.05),但兩組間無顯著差異(P＞0.05);移植后,模型組最高,其次為移植組,最低者為假手術組,3組間均有顯著差異(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組 NSS比較

2.3 免疫組化 假手術組ERK陽性細胞數為 13.42±6.91,明顯低于模型組(120.33±30.52)和 BMCs移植組(35.85±12.64)(P＜0.05),BMCs移植組明顯高于模型組(P＜0.05)。

2.4 腦梗死體積 假手術組未見梗死灶,模型組梗死體積為(53.27±20.64)mm3;BMCs移植組梗死體積為(30.31±12.95)mm3,二者差異顯著(P＜0.05)。

3 討 論

成年哺乳動物的神經細胞缺乏再生能力,其損傷后很難恢復,故缺血性腦卒中后如果不能在第一時間改善其血供,將導致缺血區神經細胞的死亡。干細胞移植是近年醫學上乃至生命科學領域的研究熱點。但是胚胎干細胞移植存在倫理、法律及取材等方面的不便,故移植治療的應用方面受到很大限制。BMCs是多能細胞,具有多項分化的潛能,在一定誘導條件下可分化為多種造血外組織,特別是中胚層和神經外胚層發育來源的組織細胞,如成骨細胞、脂肪細胞以及神經細胞和神經膠質細胞等[5,6]。尤其是神經元的分化方向,使其具有了強大的吸引力,很多研究者都嘗試將其用于治療各類神經疾病,尤其用于治療缺血性腦卒中的研究近年更為廣泛。研究人員考慮到 BMCs具有高度可塑性,且取材方便、免疫排斥反應弱,少受倫理學制約,移植方便等特點,將其應用于腦梗死的治療。

本研究成功地將 BMCs移植入梗死灶,結果表明,模型大鼠的神經功能缺損得到明顯改善,其梗死的大腦面積也明顯減小,考慮與BMCs分化為神經細胞和神經膠質細胞有關,同時我們未觀察到 BMCs移植對腦組織結構的損傷。BMCs移植的療效顯著。

腦缺血時組織低氧缺氧,細胞可以表現為壞死或凋亡,同時細胞也會啟動修復機制對其缺氧損傷進行修復。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯傳導途徑是與細胞增殖,分化及凋亡控制密切相關的細胞信號傳導途徑,ERK作為 MAPK的家族成員之一,可以介導細胞增殖、分化并促進細胞的存活。正常生理條件下 ERKs就存在于動物腦內,可被神經營養因子、神經遞質和生長因子等多種信號激活,在中樞神經系統中可通過基因表達、蛋白合成等影響神經細胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等,并且參與多種神經系統疾病的病理生理過程[7]。但是關于 ERK在缺血性腦卒中的發病過程中到底起到保護還是損傷作用各家說法不一[8～10]。

本研究結果顯示,經過造模以后,大鼠腦組織中 ERK明顯增多,說明ERK通過介導炎性反應和氧化應激反應促進缺血缺氧時的神經細胞的死亡與凋亡[11]。但是移植入BMCs后,檢測結果顯示,大鼠腦內 ERK陽性細胞數量明顯減少,表明BMCs的移植抑制了 ERK通路活性,下調 ERK蛋白的表達,保護缺血缺氧的神經細胞免受炎性反應和氧化應激反應的損傷,保護神經細胞的功能,從而達到治療缺血性腦卒中的目的。

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