芽胞抗力快速弱化技術(shù)研究

張 林,程立慶,黃國榮,向 穎,吳 龍,熊鴻燕

(第三軍醫(yī)大學軍隊流行病學教研室,重慶 400038)

芽胞抗力快速弱化技術(shù)研究

張 林,程立慶,黃國榮,向 穎,吳 龍,熊鴻燕＊

(第三軍醫(yī)大學軍隊流行病學教研室,重慶 400038)

以L-丙氨酸緩沖液為發(fā)芽劑,結(jié)合芬頓反應原理,觀察發(fā)芽-氧化損傷效應對芽胞的殺滅效果,以期為新型炭疽疫源地凈化方法的深入研究奠定基礎(chǔ)。以臘樣芽胞為試驗菌,采用透射電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、活菌計數(shù)等方法觀察芽胞發(fā)芽過程的超微結(jié)構(gòu)、核酸含量變化,以及在芬頓反應的聯(lián)合作用下發(fā)芽體的活性變化。在20～30 min的發(fā)芽過程中,芽胞核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,通透性增加,進一步有皮質(zhì)消失、細胞核與細胞質(zhì)融合、細胞膜基本形成的現(xiàn)象;發(fā)芽體熒光強度不斷增加,顯示菌體中核酸的活性和含量不斷增加;發(fā)芽體對化學因子的抗力明顯下降,H2O2濃度為0.20 mol/L的Fenton反應系統(tǒng)作用60 min時,發(fā)芽體滅活可達到3.016個對數(shù)級。誘導發(fā)芽和反應的聯(lián)合處理程序可顯著提高芽胞的滅活水平。

芽胞;發(fā)芽劑;芬頓反應

與相應繁殖體相比,細菌芽胞對理化因素的抵抗作用增加了10～75倍,常規(guī)消毒、滅菌方法完全無法清除此類微生物[1-5]。因此,專業(yè)機構(gòu)對炭疽疫源地進行洗消處置時必須采取超常規(guī)手段,即采取焚燒加高濃度化學制劑長期浸泡的方法,這些方法對環(huán)境的污染非常嚴重[6-8]。而且,根據(jù)近年來生物恐怖襲擊的特點,生物污染地往往是在人群高度集中的場所,如建筑內(nèi)、運輸工具內(nèi)和重要的交通中心等,現(xiàn)場洗消難度和低污染要求增加。因此,在生物防護技術(shù)研究中,探索并建立可靠、低污染型的現(xiàn)場凈化技術(shù)是一項迫切任務。營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、次黃嘌呤核苷等)、非營養(yǎng)物質(zhì)(吡啶二羧酸鈣)、物理(壓力、磨損等)等因素能夠啟動芽胞的萌發(fā)過程,促使其不斷生長,向繁殖體狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在這一過程中,促成細菌芽胞高抵抗力的各種因素,如豐厚的殼質(zhì)層、芽胞膜內(nèi)大量吡啶二羧酸鈣(CaDPA)包裹的蛋白酶、被α/β-酸溶性小分子蛋白(α/β-type acid-soluble spore proteins,α/β-SASP)包繞的核酸成分,以及多種核酸修復酶等逐漸降解、流失。伴隨著這些反應,芽胞的通透性逐漸增加,抗力明顯降低[9-11]。這意味著在芽胞啟動萌發(fā)程序后存在一“脆弱”期,有利于設計“致死性攻擊”方法。因此,本課題以L-丙氨酸緩沖液為發(fā)芽劑,結(jié)合芬頓反應(Fenton reaction)原理,觀察發(fā)芽-氧化損傷效應對芽胞的殺滅效果,以期為新型炭疽疫源地凈化方法的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 凍干臘樣芽胞(ATCC10987) 由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供。

1.1.2 儀器設備 透射電鏡(荷蘭飛利浦TECNA I-10型);激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP5型,德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 芽胞發(fā)芽處理 ①芽胞懸液制備[12]:取凍干臘樣芽胞用營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板進行增菌和純化培養(yǎng)。取5.0 mL第3～5代菌液于羅氏瓶進一步培養(yǎng),置于37℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)5～7 d。芽胞染色,鏡檢。當芽胞形成率達95%以上時收集芽胞。過濾芽胞懸液,清除其中的瓊脂凝塊;離心、清洗(3000 r/min離心10 min)3遍。將洗凈的芽胞懸浮于三角燒瓶內(nèi)蒸餾水中,并加入適量小玻璃珠。將芽胞液放于80℃水浴中10 min,以殺滅殘余的繁殖體。待冷至室溫后,保存于4℃冰箱中備用;②L-丙氨酸發(fā)芽劑制備:將L-丙氨酸(加拿大B I O BASIC I NC)加入10 mmol/L Tris/HCl(pH 8.5)緩沖液中,使L-丙氨酸終濃度為200 mmol/L;③引導發(fā)芽:將稀釋于PBS緩沖液中的芽胞(107cfu/mL左右)在70℃恒溫水浴箱水浴30 min,然后37℃孵育15 min[13-15];以1∶1的比例將芽胞懸液加入發(fā)芽劑中,在室溫下作用20 min。

1.2.2 發(fā)芽過程的形態(tài)學觀察 ①透射電鏡觀察:將2～3 mL經(jīng)發(fā)芽劑處理的芽胞懸液離心(2000～2500 r/min),使芽胞成團,用適量2.5%戊二醛進行固定。0.1 mol/L PBS漂洗2次,用1%鋨酸進行后固定2 h,再用0.1 mol/L PBS漂洗2次,用丙酮梯度脫水后浸透包埋、脫水、切片、雙鉛染色,在透射電鏡下觀察(80 KV),每個樣本觀察20～30個視野;②激光掃描共聚焦顯微鏡觀察[16]:吸取萌發(fā)后的芽胞懸液樣本20～30μL滴加在載玻片上,用30～50μL 2.5%戊二醛進行固定,再滴加50～100μL 100 ng/mL DAPI熒光染液(4′,6-diamidino-2-phenylindole;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚),使其覆蓋樣品,染色10 min后,用新鮮配置的PBS緩沖液輕輕沖洗2～3次,蓋上蓋玻片,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 芬頓反應殺菌試驗 芬頓反應系統(tǒng)的設計:按照經(jīng)典的芬頓反應方法[17],以H2O2、Fe2+和EDTA為核心成分,制備3個芬頓反應系統(tǒng)。3個系統(tǒng)中,H2O2濃度分別為0.05、0.1、0.2 mol/L,H2O2與Fe2+摩爾比為9∶1。稀釋液為二次去離子水。殺菌試驗:按照《消毒技術(shù)規(guī)范》要求[12],室溫下,在無菌大試管中加入0.5 mL發(fā)芽的芽胞混懸液,再加入0.5 mL有機干擾物質(zhì),混勻,置20℃水浴5 min,分別加入3種芬頓反應系統(tǒng)的反應液4.0 mL與其混合,在10、30、60 min時分別取混懸液0.5 mL,置于4.5 mL 1 mmol/L二甲基亞砜液(中和劑)中,中和10 min后分別取1.0 mL進行活菌計數(shù)。試驗同時,以芽胞為對象,在相同條件下進行芬頓反應的殺菌觀察,以作為對照觀察;此外,以芬頓反應所用稀釋液代替芬頓反應液,進行平行試驗,作為空白對照組;以濃度1.00 mol/L H2O2液代替芬頓反應液,進行平行試驗,作為實驗對照組。各試驗點均平行3個樣本試驗。以上試驗中芽胞濃度為1.8×107/mL;芽胞發(fā)芽體的濃度為1.8×107/mL。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)芽過程中芽胞的超微結(jié)構(gòu)變化觀察

從超微結(jié)構(gòu)觀察可見(見圖1),發(fā)芽20 min時的芽胞核心密度降低,核心與殼質(zhì)、殼質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,通透性增加;30 min時的芽胞殼質(zhì)消失,細胞膜基本形成,細胞核與細胞質(zhì)融合。

2.2 發(fā)芽過程中菌體的超微結(jié)構(gòu)變化觀察

經(jīng)DAPI熒光染色后,隨著發(fā)芽時間的增加發(fā)芽體熒光強度不斷增加(見圖2),顯示菌體中核酸的活性和含量不斷增加。

圖1 芽胞發(fā)芽過程的超微結(jié)構(gòu)變化(37000×)Fig.1 The ultrastructure changes of spore germination(37000×) a、b、c:不同切面正常芽胞:結(jié)構(gòu)清晰,核心、皮質(zhì)、芽胞衣、外壁很完整,b圖還可見核心和皮質(zhì)之間的內(nèi)膜,皮質(zhì)和芽胞衣之間的外膜;d、e、f:發(fā)芽20 min的菌體:核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂;g、h、i:發(fā)芽30 min時菌體:芽胞皮質(zhì)消失,細胞膜基本形成,細胞核與細胞質(zhì)融合

圖2 芽胞發(fā)芽過程中核酸熒光染色變化(1000×)Fig.2 Nucleic acid fluorescent staining changes of spore germination(1000×) a:正常芽胞;b:發(fā)芽20 min時的菌體;c:發(fā)芽30 min時的菌體

2.3 芬頓反應系統(tǒng)對芽胞和發(fā)芽體的殺滅作用

殺菌試驗顯示,芽胞對單純的H2O2溶液有明顯的抗力,經(jīng)濃度為1.00 mol/L的H2O2溶液作用60 min時只能達到0.084個對數(shù)級的殺滅效果。但發(fā)芽體抗力明顯下降,相同濃度和作用時間殺滅數(shù)量達到1.229個對數(shù)級。與單純的H2O2溶液相比,芬頓反應系統(tǒng)有明顯的殺菌增效作用,H2O2濃度為0.20 mol/L的在反應系統(tǒng)中作用60 min時,芽胞殺滅數(shù)量可達到0.129個對數(shù)級,發(fā)芽體可達到3.016個對數(shù)級。

表1 芬頓反應系統(tǒng)和單純的H2O2溶液殺菌作用Table 1 The sterilization effect of Fenton reagent and hydrogen peroxide on spore

3 討 論

發(fā)芽誘導與芬頓反應系統(tǒng)的殺菌作用:細菌芽胞的高抵抗Fe2+力是與其豐厚的外壁、皮質(zhì)、芽胞膜內(nèi)大量吡啶二羧酸鈣(CaDPA)包裹的蛋白酶、被α/β-酸溶性小分子芽胞蛋白(α/β-type acid-soluble spore proteins,α/β-SASP)浸潤的核酸成分,以及多種核酸修復酶等因素密切相關(guān)的。在萌發(fā)過程中,進入始動期(initiation)末時,各種促成芽胞具有高抗力的因素逐漸瓦解,如CaDPA的大量外流以及α/β-SASP迅速降解,芽胞的通透性增加,抗力明顯降低。這就意味著,促使芽胞啟動萌發(fā)過程而后進行攻擊是殺滅芽胞的一個有效途徑。近年來,國內(nèi)外研究者開始利用這種原理,探索了理化因素、生物酶和噬菌體等與其聯(lián)合作用的殺菌效果,相關(guān)結(jié)果展示出可喜的應用前景[18-20]。

本研究利用濃度為200 mmol/L L-丙氨酸發(fā)芽劑誘導芽胞發(fā)芽,在發(fā)芽劑作用20～30 min時,芽胞核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,進一步皮質(zhì)消失,細胞核融合,細胞膜基本形成,包體核酸的活性顯著提高,菌體抗力降低,在H2O2濃度為0.2 mol/L的反應條件下,發(fā)芽芽胞的殺滅量達到3個對數(shù)級。基本實現(xiàn)了低殺菌劑濃度,高滴度滅活菌體的目標。但是,此處理方式不能進一步提高對菌體的殺滅程度,其原因可能是在發(fā)芽誘導程序中少量芽胞(10%左右)未能復蘇發(fā)芽。因此,在進一步研究中,將探索改良發(fā)芽程序,以提高發(fā)芽率。

芬頓反應的應用價值:芬頓反應[21]是利用催化劑或光輻射或電化學作用,通過H2O2產(chǎn)生羥基自由基(·OH)處理有機物的技術(shù)。系統(tǒng)中主要成分為H2O2和Fe2+,其中H2O2與Fe2+的比例一般在5～25∶1,pH 3～5。H2O2在Fe2+的催化作用下分解產(chǎn)生·OH。羥基自由基的氧化電位達到2.8 V,是除元素氟外最強的無機氧化劑,可通過電子轉(zhuǎn)移等途徑將有機物(羧酸、醇、酯等有機化合物)氧化分解成無機小分子,這種反應體系即可以殺滅細菌,又可以分解有機物。

芬頓反應中,Fe2+被氧化成Fe3+,同時分解H2O2并釋放·OH。新生成的Fe3+一部分發(fā)生水解,另一部分繼續(xù)參與反應,重新被還原成Fe2+。在此體系中,pH、H2O2濃度、Fe2+/Fe3+比例均可影響·OH水平。有研究顯示,在低Fe2+的量時,增加其投加量可有效促進羥基自由基的生成;過高濃度的Fe2+在氧化過程中,將導致反應啟動過程中雙氧水被迅速催化產(chǎn)生大量活性羥基自由基,造成游離羥基自由基的積聚,使自由基自身反應,反而影響對有機物的氧化作用[22]。本研究以細菌芽胞的發(fā)芽體為試驗對象,經(jīng)過實驗篩選,從反應效果和處理成本因素考慮,將Fe2+與H2O2摩爾比設為1∶9。研究結(jié)果可見,在芬頓反應中, H2O2濃度為0.2 mol/L的反應體系可殺滅發(fā)芽芽胞體3.016個對數(shù)級,而單純的H2O2溶液在濃度為1.0 mol/L時只能殺滅1.229個對數(shù)級。顯示系統(tǒng)中產(chǎn)生的·OH有更高的殺菌效應。由于·OH存在濃度低、反應活性大、壽命短,滯留的毒性和污染問題小,因此,在深入研究進一步提高殺滅效率的基礎(chǔ)上,將芬頓反應與發(fā)芽劑結(jié)合,作為疫源地的洗消制劑是值得推廣的。

[1]Blatchley E R,ASCE AM,Meeusen A,et al.Inactivation of Bacillus Spores by Ultraviolet or Gamma Radiation[J].Journal of environmental engineering,2005,1251:1245-1251.

[2]Knudson,G.B.Photoreactivation of ultraviolet-irradiated,plasmid-bearing and plasmid-free strains of Bacillus-anthrac[J]. Appl.Environ.Microbiol,1986,52(3):444-449.

[3]Nicholson WL,Munakata N,Horneck G,et al.Resistance of Bacillus endosporesto extreme terrestrial and extraterrestrial environments.Microbiol[J].Mol.Biol.Rev,2000,64(3):548.

[4]Setlow P.DNA in dormant spores of Bacillus speciesis in an A-like conformation.Mol[J].Microbiol,1992,6(5):563-567.

[5]Setlow P.I will survive—Protecting and repairing spore DNA [J].J.Bacteriol,1992,174(9):2737-2741.

[6]Manchee RJ,Brosler MG,Stagg A J,et al.Formaldehyde solution effectively inactivates spores of Bacillus anthracison the Scottish Island of Gruinard[J].Appl Environ Microbiol,1994, 60(11):4167-4171.

[7]楊瑞馥.炭疽芽胞恐怖及其相關(guān)問題[J].軍事醫(yī)學科學院院刊,2002,26(1):1-4.

[8]Cieslak TJ,Eitzen EM Jr.Bioterrorism:agents of concern[J]. J Public Health Manag Pract,2000,6(4):19-29.

[9]Setlow P.I will survive:DNA protection in bacterial spores [J].Trends in Microbiol,2007,15(4):172-180.

[10]Setlow P.Spore germination[J].Current Opinion in Microbiology,2003,6(6):550-556.

[11]Raju,D.Waters M,Setlow P,et al.Investigating the role of small,acid-soluble spore proteins(SASPs)in the resistance of Clostridium perfringensspores to heat[J].BMC Microbiol, 2006,6:50.

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部.消毒技術(shù)規(guī)范[S].2002:15-44.

[13]Wuytack EY,Soons J,Poschet,et al.Comparative study of pressure-and nutrient-induced germination ofBacillus subtilis spores[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(1):257-261.

[14]Clements MO,Moir A.Role of the ger I Operon of Bacillus cereus 569 in the Response of Spores to Germinants[J].J.Bacteriol, 1998,180(24):6729-6735.

[15]Broussolle V,Gauillard F,Nguyen-The C,et al.Diversity of spore germination in response to inosine and L-alanine and its interaction with NaCl and pH in the Bacillus cereusgroup[J].J Appl Microbiol,2008,105(4):1081-1090.

[16]http://www.microimage.com.cn/uploadfile/xwjs/uploadfile/ 201007/20100713023815328.pdf

[17]孫德智.環(huán)境工程中的高級氧化技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2002:125-139.

[18]Hornstra LM,Leeuw PLA,Moezelaar R,et al.Germination of Bacillus cereusspore adhered to stainless steel[J].International Journal of Food Microbiology,2007,116(3):367-371.

[19]張利軍,熊鴻燕,張耀,等.營養(yǎng)啟動劑誘導類炭疽芽胞發(fā)芽的研究[J].中華流行病學雜志,2005,26(3):203-210.

[20]Akhtar S,Paredes-Sabja D,Torres J.A,et al.Strategy to inactivate Clostridium perfringensspores in meat products[J].Food Microbiology 2009,26(3):272-277.

[21]http://www.lenntech.com/fenton-reaction.htm

[22]苑寶玲,陳一萍,李艷波,等.Fenton催化氧化降解藻毒素MCLR的效能研究[J].環(huán)境科學學報,2005,07(7):925-929.

Rapid Weakening Techniques of Germ Resistance

ZHANG Lin,CHENG Li-qing,HUANG Guo-rong,XIANG Ying,WU Long,XIONG Hong-yan
(Teach.&Res.Div.of Troops Epidemics,The Third Milt.Med.Uni.,Chongqing400038)

Based on the germination agent of L-alanine buffer combined with the principle of Fendun reaction,the killing result of germination-oxidation traumatic effects against germ were observed so as to lay down foundation of studying deeply on cleaning methods of the epidemic source new type of anthrax.The germ of Bacillus cereus was used as a test bacteria and observed its super microstructure of its germination process,content changes of nucleic acid through trans mission electron microscope,laser scanning confocal microscope,living cell counting etc.,as well as the activity changes of germinant body under the united effect of Fenton method.The results showed that during the germinant process in 20～30 min.the density of core were decreased and the margins between core and cortex,the bounds cortex and exospore were blurred;and there were some break at the exospore and coat,the per meability increased, some cortex vanished,nuclei and protoplasm fused,and cell membrane basically formed,and fluorescence intensity germination body continuously increased,indicating the activity and content of nucleic acid of thallus continuously increased;the resistance of germination body against chemical factor obviously decreased.After treated by Fenton reaction(0.2 mol H2O2)for 60 min,the inactivation of germination body was as high as 3.016 logarithmic level.Therefore,joint treatment procedure of germination with reaction could obviously increase the inactivation level of germs.

spore;germination agent;Fenton reaction

Q939.1

A

1005-7021(2010)06-0027-05

重慶市科委攻關(guān)課題(CSTC,2008AC5005)

張林 男,碩士研究生。主要從事傳染病流行病學研究。E-mail:monkcrazy@126.com

＊通訊作者。Tel:023-68752287,E-mail:hongyanxiong@sohu.com

2010-10-25;

2010-11-20