柿葉黃酮對BSD-2菌株芽胞數量及抑菌活性的影響

尹淑麗,張麗萍,梁 然,黃亞麗,張 蕾,段普凡＊

(1.河北省科學院生物研究所,河北石家莊 050081;2.鹿泉銅冶農業技術推廣區域站,河北鹿泉 050200)

柿葉黃酮對BSD-2菌株芽胞數量及抑菌活性的影響

尹淑麗1,張麗萍1,梁 然2,黃亞麗1,張 蕾1,段普凡1＊

(1.河北省科學院生物研究所,河北石家莊 050081;2.鹿泉銅冶農業技術推廣區域站,河北鹿泉 050200)

研究PB液體培養基中加入不同濃度的柿葉黃酮對內生枯草芽胞桿菌生長、芽胞形成及抑菌活性的影響,利用光學顯微鏡觀察菌體形態、稀釋平板法統計芽胞數量、平板擴散法和病原菌生物測定的方法測定抑菌效果。結果表明,加入柿葉黃酮濃度為0.5%的處理對菌體生長無影響,使芽胞數量提高100倍,同時增強對灰霉、黑斑、黃萎病原菌的抑菌效果。

柿葉黃酮;芽胞數量;抑菌活性

植物病害是影響農業高產穩產和優質的主要因素之一,目前主要采用化學方法進行防治,但化學殺菌劑過量會造成嚴重的環境污染、破壞生態平衡、誘導病原菌產生抗藥性,它的殘留問題也令人擔憂,因此植物病害的生物防治研究越來越受到重視。病害生物防治的關鍵是高效生防菌株的獲得,內生菌長期生活在植物體內與植物協同進化,一方面植物體為其提供生長必需的能量和營養;另一方面,內生細菌又可通過自身的代謝產物或借助于信號傳導作用對植物體產生影響[1]。近年來對內生菌在植物病害生物防治方面的應用成為研究的熱點,Chen[2]、Brooks[3]、夏正俊[4]、吳藹民[5]和林玲[6]從植物組織內分離到內生細菌,對植物病原真菌有較好抑制作用,防治效果較好。本試驗室從健壯植物組織中分離到1株枯草芽胞桿菌BSD-2,抑菌譜較寬,其芽胞制成的生物菌劑及代謝產物制成的葉面噴施劑對植物的土傳、氣傳病害的抑制作用較好,且取得了一定的應用效果,因此提高益生菌株BSD-2芽胞的數量及代謝產物的抑菌活性成為生產生防制劑的重要環節。柿樹是我國北方的重要經濟作物之一,隨著對柿葉的化學成分和生理活性的研究越來越深入,發現柿(D iospyros kakiL inn)葉的黃酮類物質是最主要有效成分之一[7],具有促進植物生長、發育、開花、結果及抗菌防病的效果。隨著對柿葉黃酮認識和效果的肯定,黃酮提取和含量測定方面[8-13]及在植物栽培中的應用等方面的研究逐漸增多,但柿葉黃酮對益生芽胞桿菌芽胞數量及代謝產物抑菌活性方面的研究少有報道。本研究采用石家莊山區柿子產地的柿葉,提取柿葉粗黃酮,探討它的加入對內生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株芽胞數量及代謝產物抑菌活性的影響,為提高微生物制劑的生防效果奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 柿葉 黃酮的提取參照馬桂榮[12]的方法,1 g干柿子葉可提取粗黃酮0.04 g。

1.1.2 供試菌株 枯草芽胞桿菌(B acillus subtilis)BSD-2、黃瓜灰霉(B otrytis cinerea)、梨黑斑(A lternaria kikuchiana)、棉花黃萎(Verticillium wilt)病植物病原菌為該實驗室分離保存。

1.1.3 培養基 ①PB培養基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,瓊脂粉1.2%,pH 7.2～7.4(不加瓊脂粉即為PB液體培養基);②PDA培養基:土豆20%,葡萄糖2%,瓊脂粉1.2%,pH自然。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 設置5種不同柿葉黃酮的加入濃度,處理1加入濃度為5%,處理2加入1%,處理3加入0.5%,處理4加入0.25%,處理5液體PB培養基為對照,每個處理設置3個重復。實驗采用液體PB培養基,250 mL三角瓶裝量為50 mL。種子液培養15 h時轉接,按5%的接種量接種,30℃、200 r/min,培養48 h,培養液待用。

1.2.2 測定內容 ①菌體形態觀察:將培養48 h的培養液固定、染色后,于光學顯微鏡下放大1000倍觀察菌體形態;②芽胞數量統計:將不同處理的培養液置于80℃水浴10 min后,取1 mL接入99 mL無菌水中稀釋,直至稀釋終濃度達到10-6、10-7、10-8,吸取0.1 mL稀釋液涂布PB平板,活菌計數。

1.2.3 抑菌活性的測定 將各處理的培養液離心后,經0.22μm的濾膜過濾除菌,以灰霉病原菌為指示菌,采用平板擴散的方法,測定不同處理對代謝產物抑菌活性的影響。

1.2.4 對病原菌抑菌率的測定 試驗設置5個處理,加入濃度1%、0.5%、0.25%的3個不同濃度處理,PB培養基對照處理,PDA培養基空白對照處理。將1%、0.5%、0.25%、PB培養基對照4個處理的除菌濾液,以10%的濃度加入到固體PDA培養基中制成含藥培養基。以灰霉、黑斑、黃萎3種病原菌為指示菌,采用病原菌菌餅生長量測定的方法測定抑菌率。

2 結 果

2.1 不同柿葉黃酮加入濃度對內生枯草芽胞桿菌菌體生長及芽胞數量的影響

表1 不同處理的菌體形態Table 1 The cellmorphology of different treatment

圖1 菌體自溶及變形Fig.1 The cell deformation and autolysis

圖2 正常芽胞Fig.2 The normal spores

由表1可見,柿葉黃酮加入濃度為5%時,內生枯草芽胞桿菌BSD-2的菌體不能正常生長,在菌體生長調整期時發生菌體自溶(圖1),導致不能形成芽胞。其他濃度處理對菌體形態及芽胞的形成無影響,可形成正常的芽胞(圖2)。

圖3 不同處理對芽胞數量的影響Fig.3 The number of spores of different treatment

由圖3可知,柿葉黃酮加入濃度為1%、0.5%、0.25%的處理芽胞數量明顯高于對照,并且柿葉黃酮的加入量與芽胞數量呈正向關系;與對照的芽胞數量相比,加入濃度1%、0.5%的處理可以提高100倍。

2.2 不同處理對代謝產物抑菌活性的影響

圖4 抑菌效果Fig.4 The inhibitory effects

由圖4可知,加入濃度為5%的處理對灰霉病原菌沒有抑制作用,加入濃度為1%和0.25%的處理對灰霉病的抑制作用較小,加入濃度為0.5%的處理抑菌效果與對照PB培養基處理相當。可見,在液體培養基中添加不同濃度柿葉黃酮,可影響內生枯草芽胞桿菌代謝產物的抑菌活性,加入濃度為5%、1%和0.25%的處理對代謝產物的抑菌活性有降低的影響,而加入濃度為0.5%的處理對代謝產物的抑菌活性無影響。

2.3 對病原菌抑制率的影響

圖5 不同處理對灰霉抑菌率的影響Fig.5 The antibacterial rate of different treatment to the Botrytis cinerea

圖6 不同處理對黑斑抑菌率的影響Fig.6 The antibacterial rate of different treatment to the Alternaria Kikuchiana

圖7 不同處理對黃萎抑菌率的影響Fig.7 The antibacterial rate of different treatment to the Verticillium wilt

由圖5、6、7可知,液體PB培養基中加入0.5%的柿葉黃酮,利于內生枯草芽胞桿菌抑菌活性物質的產生,可明顯提高對灰霉病、黑斑、黃萎原菌的抑菌率。加入0.25%的柿葉黃酮,對黑斑病原菌的抑菌率與對照相當,對灰霉、黃萎的抑菌率明顯低于對照;加入1%的柿葉黃酮,對灰霉、黃萎的抑菌率與對照相當,對黑斑的抑菌率明顯低于對照。

3 討 論

柿葉黃酮可提高內生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株的芽胞數量,在液體培養基中加入濃度1%、0.5%、0.25%的柿葉黃酮,隨柿葉黃酮加入量的增加,芽胞的數量增加,且呈現正相關。可見柿葉黃酮可提高內生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株的芽胞數量。不同柿葉黃酮的加入濃度對內生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株代謝產物抑菌活性的影響不同,加入0.5%的柿葉黃酮可明顯提高對灰霉、黑斑、黃萎病原菌的抑菌率。可見在內生枯草芽胞桿菌生長過程中柿葉黃酮能夠協助抑菌活性物質的產生,使得其抑菌活性增強。

該菌株代謝產物中的抑菌活性物質是一種穩定性較好的小肽[14],適于作為液體噴施劑用于植物真菌病害的生物防治中。該菌株是內生枯草芽胞桿菌,作為生防菌劑在土壤中定植后利于在植物體內的定植、傳導,充分發揮其抑菌作用。

柿葉黃酮的加入在有效提高該菌株芽胞數量的同時,也提高了該菌株抑菌活性物質的產生,對提高由該菌株研制的生防菌劑的殺菌效果具有較大潛力。我國柿葉資源廣闊,有效加以利用既可降低生物殺菌劑生產的成本,又可有效利用廢棄的生物質資源。

本研究為柿葉黃酮在微生物生防制劑生產上的廣泛應用提供理論基礎,為進一步深入研究奠定試驗基礎。對于柿葉黃酮提高芽胞數量和增強代謝產物抑菌活性的作用機制有待進一步深入研究。

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The Effect of Persimmon Flavone on Spores Number and Antibacterial Activity of BSD-2

YIN Shu-li1,ZHANG Li-ping1,LIANG Ran2,HUANG Ya-li1,ZHANG Lei1,DUAN Pu-fan1
(1.Inst.of Biol.,Hebei Acad.of Sci.050081;2.Luquan Tongye Regional Agrotechnical Sta.,050200)

Different concentrations of persimmon flavone(pf)were added to PB liquid medium to study its effects on the growth,sporulation,and antimicrobial activity of Bacillus subtilis,cell morphology was observed through optical microscope,the number of spores was counted by the traditional dilution plate method,inhibitory effects was tested by the plate diffusion method and pathogenic organisms determination.The results showed that the treatment of pf at 0.5%had no effect on the growth of the cells and made the number of spores increased 100 times,while enhancing the antibacterial effect on the Botrytis cinerea,Alternaria kikuchiana,and Verticillium wilt.

persimmon flavone;spore number;antimicrobial activity

Q93

A

1005-7021(2010)06-0047-04

河北省科技支撐計劃項目(08215501D);河北省財政預算項目(10307);河北省基金項目(C110412)

尹淑麗 女,碩士,助理研究員。主要從事利用微生物生物防治真菌病害的工作。E-mail:yslbaihelr@126.com

＊通訊作者。Tel:0311-83014879,E-mail:hbsjzddll@yahoo.com.cn

2010-10-13;

2010-11-22