HPLC測定青蒿植株不同部位的東莨菪內酯含量

吳蜀瑤，李敏，王佳黎

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

質量標準

HPLC測定青蒿植株不同部位的東莨菪內酯含量

吳蜀瑤，李敏*，王佳黎

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

目的：建立高效液相色譜法測定青蒿中東莨菪內酯的含量，并對青蒿植株不同部位的東莨菪內酯的含量進行比較。方法：Kromasil ODS-1色譜柱(250mm×4.6mm)，甲醇-水(40∶60)為流動相，測定波長：344nm，流速：0.8mL·min-1，柱溫：25℃，進樣量：15μL。結果:東莨菪內酯在0.077 5～0.31μg呈良好線性關系，r=0.999 9，平均回收率為99.74%，RSD=2.33%。結論：該方法靈敏度高，準確度和穩定性較好，測定方法可靠，可用于青蒿中東莨菪內酯的含量測定。測定結果表明，青蒿各部位的含量依次為：葉>花>根>子>莖。

青蒿；高效液相色譜法；東莨菪內酯

青蒿來源于菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分[1]，其味苦、辛，性寒，具清熱解暑，除蒸，截瘧功能。臨床上用于暑邪發熱，陰虛發熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸[2]。除青蒿地上部分外，《本草綱目》青蒿條下亦收載有青蒿根及青蒿子，謂其根“苦、寒、無毒”，“青蒿子甘、冷、無毒。功用和青蒿葉相同。”此外，《江蘇省中藥材標準》(1989年版)也收載了青蒿子。另外，古代醫藥方書中有一些單方或復方使用青蒿根及子治療多種疾病的記載。

據文獻報道，青蒿中的香豆素類成分主要有東莨菪內酯、香豆素等。而東莨菪內酯具有抗炎、鎮痛、祛痰、平喘等藥理作用，為青蒿的有效成分之一[3，4]。本文以東莨菪內酯為指標性成分，建立高效液相色譜法測定青蒿中東莨菪內酯的含量，并比較青蒿不同植株部位中該成分含量的差異，不僅對青蒿藥材和制劑的質量控制提供了科學依據，同時也為擴大黃花蒿的藥用資源提供了參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian高效液相色譜儀；KQ-3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP121S電子天平(德國賽多利斯股份公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2 試藥

HPLC用甲醇為色譜純，水為純凈水；其余試劑均為分析純。東莨菪內酯對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號110768-200504)。

青蒿藥材采自四川省安岳縣青蒿基地，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為菊科植物黃花蒿ArtemisisaannuaL.的干燥全株。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil ODS-1(250mm×4.6mm)；流動相：甲醇-水(40∶60)；測定波長：344nm；流速：0.8mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：15μL。在該條件下，東莨菪內酯色譜峰與相鄰色譜峰達到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數按東莨菪內酯峰計算為3 000以上。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取東莨菪內酯對照品15.5mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(0.155mg·mL-1)。臨用前精密量取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.015 5mg·mL-1的對照品溶液。

2.3 線性范圍的考察

分別吸取上述0.015 5mg·mL-1的對照品溶液5，10，12.5，15，20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積。以東莨菪內酯進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=37 649 520.0X+1 202 600.1，r=0.999 9。結果表明，東莨菪內酯在0.077 5～0.31μg呈良好線性關系，對照品色譜圖見圖1。

A.東莨菪內酯對照品 B.葉 C.花 D.莖 E.子 F.根圖1 東莨菪內酯對照品及青蒿HPLC圖

2.4 供試品溶液制備方法的考察和確定

本次實驗對提取過程中影響提取效率的提取方式、提取溶劑、溶劑體積三因素進行考察。實驗結果以東莨菪內酯含量為指標，選用青蒿全株進行樣品制備，按照L9(34)正交表進行實驗。實驗結果表明，以超聲60min、甲醇15mL提取為供試品的最佳提取方案，即：取藥材粉末約0.25g(平行2份)，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加入甲醇15mL，稱定重量，超聲處理60min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液，即得。

2.5 精密度試驗

精密吸取東莨菪內酯對照品溶液(0.015 5mg·mL-1)15μL注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定峰面積值，RSD=0.98%，說明該方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

按照擬定的方法，取同一樣品，平行6份，制備成供試品溶液，進樣15μL，測得峰面積，并計算東莨菪內酯的含量。平均含量為0.819 8mg·g-1，RSD=1.05%，說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

按照擬定的方法制備供試品溶液，室溫密閉保存，分別于0,1,2,4,8,10h進樣15μL，計算樣品中的東莨菪內酯峰面積值，RSD=1.62%。試驗表明，供試品溶液可在室溫下密閉保存10h，不影響測定結果。

2.8 回收率試驗

取同一已知含量的青蒿全株樣品粉末9份，每份約0.10g，精密稱定，分別精密加入東莨菪內酯對照品(0.155mg·mL-1)0.4,0.4,0.4,0.6,0.6,0.6,0.8,0.8,0.8mL，按照已確定的方法制備供試品溶液并依法測定,結果見表1。

表1 東莨菪內酯加樣回收試驗

回收率試驗結果表明，3種水平9次試驗的加樣回收率測得結果均在95%～105%，說明東莨菪內酯的提取和檢測方法可行。

2.9樣品的含量測定

取青蒿葉、花、莖、根、子藥材各約0.25g，平行兩份(n=2)，精密稱定，按上述含量測定方法進行測定，結果見表2，色譜圖見圖1。

表2 青蒿子、葉、花、莖、根的含量測定 /mg·g-1

3 討論

通過紫外分光光度計對東莨菪內酯對照品的甲醇溶液，在200～400nm波長進行掃描,結果發現，東莨菪內酯在255nm,260nm以及344nm處均有吸收峰，由于在前兩者的波長下干擾峰較多，分離度較差，而在344nm處靈敏度高，雜質干擾小，故選擇344nm為含量測定的波長。

在對供試品溶液提取方法進行正交試驗時，確定了3個對提取方法產生主要影響的因素，其中提取方式選用了超聲60min、回流60min、溫浸(45℃，10h)3個水平，提取溶劑選用甲醇、85%甲醇、95%乙醇3個水平，提取溶劑的體積選用10，15，20mL 3個水平進行正交試驗。另外，由于曾做過超

聲40，60，80min的單因素考察，發現供試品溶液在60min時已基本提取完全，故未將提取時間再列入因素表進行考察。

本實驗建立了青蒿中東莨菪內酯的HPLC含量測定方法，通過方法學考察表明，該方法靈敏度高，準確度和穩定性較好，測定方法可靠。用該方法測定的結果為：青蒿葉中東莨菪內酯的含量最高，達1.210 6mg·g-1，而青蒿莖的含量最低，僅為0.082 7mg·g-1，青蒿葉中東莨菪內酯含量約為莖中含量的14倍。

[1] 肖培根.新編中藥志(第三卷)[M].北京：化學工業出版社，2001：154.

[2] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(精選本)[M].上海：上海科學技術出版社，1998：1851.

[3] 楊嵐，王滿元，張東，等.青蒿藥材中東莨菪內酯的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12(10)：10-11.

[4] 陳玉敏，曹紅，周蘇萍.高效液相色譜法測定丁公藤中東莨菪內酯的含量[J].中成藥，2005，27(12)：1461-1462.

DeterminationofScopoletineinDifferentPartsofQinghaobyHPLC

Wu Shuyao, Li Min, Wang Jiali

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,ChengduSichuan611137,China)

Objective: To establish HPLC method for the determination of Scopoletine in Qinghao and analyze Scopoletine contents in differdnt parts of Qinghao.Methods: Scopoletine in Qinghao was determined by HPLC with Kromasil ODS-1 column(250mm×4.6mm).The mobile phase was methanol-water(40∶60). The detection wavelength was 344nm. The column temperature was 25℃, the flow rate was 0.8mL·min-1, and the sampling volume was 15μL.Results: The linearity of Scopoletine was good in range of 0.077 5～0.31μg (r=0.999 9). The average recovery was 99.74%, RSD was 2.33%.Conclusion: The method is simple, accurate, repeatable and suitable for the determination of Scopoletine in Qinghao. The results show that the contents of Scopoletine in different parts of Qinghao are: leaf>flowers> roots> fruit> stems.

Artemisia annua; HPLC; Scopoletine

*李敏，E-mail：028limin@163.com

2010-03-24)