香丹滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李敏，雷慶忠，李桂生，李延團(tuán)

(1.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島 266003； 2.山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 264003)

香丹滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李敏1*，雷慶忠2，李桂生2，李延團(tuán)1

(1.中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島 266003； 2.山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 264003)

目的：建立香丹滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TLC鑒別制劑中的降香和丹參；采用HPLC測(cè)定制劑中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量，色譜條件分別為Discovery C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-磷酸(15∶65∶20∶0.3)和乙腈-水-甲酸(22∶78∶1.5)，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm和286nm。結(jié)果：在TLC色譜圖中均能檢測(cè)出降香和丹參。丹參酮ⅡA線性范圍2.6～81.6μg·mL-1，回收率為99.19%，RSD=1.34%；丹酚酸B線性范圍50～800μg·mL-1，回收率為98.84%，RSD=1.74%。結(jié)論：所建立鑒別方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，定量方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于香丹滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

香丹滴丸；HPLC；TLC；丹參酮ⅡA；丹酚酸B

香丹滴丸是由香丹注射液(部頒標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3289-98)改變提取工藝和劑型而來(lái)，具有擴(kuò)張血管，增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量等功效，為了適應(yīng)注射劑制備工藝要求，原制備工藝中主要提取降香和丹參兩味藥材的水溶性部分，棄去具有藥理活性的脂溶性部分。大量文獻(xiàn)和臨床報(bào)道降香揮發(fā)油是降香藥材的主要活性成分，具有行氣止痛，活血止血作用，臨床上主要用于冠心病的治療[1,2]；丹參中脂溶性成分丹參酮和水溶性成分丹參酚酸類(lèi)對(duì)心臟和血管性疾病都有很好的防治作用[3-5]。故我們?cè)谠瓌┬偷幕A(chǔ)上根據(jù)新劑型的特點(diǎn)及藥效學(xué)研究結(jié)果，對(duì)原劑型中的降香和丹參提取工藝進(jìn)行了重大改進(jìn)，采用水蒸氣蒸餾法提取降香中的揮發(fā)油，采用酸水滲漉法和乙醇滲漉法分別提取丹參中的酚酸類(lèi)成分和菲醌類(lèi)成分，制成滴丸劑。香丹滴丸原料是由丹參水提取物、醇提取物及降香揮發(fā)油組成，按照中醫(yī)藥理論，丹參善入心及心包經(jīng)祛瘀止痛，活血通脈；降香能行氣活血，止痛止血。丹參與降香等量相伍為用，氣血并治，是一祛瘀行氣止痛的佳方。為了有效地控制該制劑質(zhì)量，保證其臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用TLC對(duì)制劑中的丹酚酸B、丹參酮ⅡA和降香揮發(fā)油進(jìn)行了定性研究，同時(shí)采用HPLC對(duì)制劑中丹參的主要活性成分丹酚酸B和丹參酮ⅡA進(jìn)行了含量測(cè)定,建立了可靠、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TSP SpectraSYSTEM P1000型高效液相泵系統(tǒng)；TSP Spectra100紫外檢測(cè)器；CHROMTEK色譜工作站；Discovery C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；CBL Model 100型柱溫箱。

1.2 試藥

丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)111562-200302)、丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)110766-200416)、降香對(duì)照藥材(批號(hào)120952-200506)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇為色譜純，水為去離子水，其他試劑為化學(xué)純；硅膠G薄層板(山東煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所)；香丹滴丸(山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心自制，批號(hào)091006，091008，091010)。

2 薄層色譜鑒別

2.1 丹參酮ⅡA的TLC鑒別

取本品60丸，研碎，加75%甲醇10mL，超聲處理10min，作為供試品溶液。另取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加75%甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方配比，去除丹參，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB)[6]，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以苯-醋酸乙酯(19∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的暗紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.2 丹酚酸B的TLC鑒別

取本品60丸，研碎，加75%甲醇10mL，超聲處理10min，精密吸取1mL，置10mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取丹參酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加75%甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；再按處方配比，去除丹參，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB)[6]，吸取上述3種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。結(jié)果在供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

2.3 降香揮發(fā)油的TLC鑒別

取本品30丸，研碎，置具塞錐形瓶中，加乙醚10mL，振搖2min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)?mL乙醇溶解，作為供試品溶液。另取降香對(duì)照藥材粉末約2g，加乙醚20mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為對(duì)照品溶液。再按處方配比，去除降香，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB)[6]，吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙醚-三氯甲烷(7∶2∶11)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸與無(wú)水乙醇(1∶9)的混合溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果在供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

1.丹參酮ⅡA對(duì)照品;2～4.香丹滴丸;5.缺丹參的陰性樣品圖1 香丹滴丸中丹參酮ⅡA的TLC色譜圖1.丹參酚酸B對(duì)照品;2～4.香丹滴丸;5.缺丹參的陰性樣品圖2 香丹滴丸中丹參酚酸B的TLC色譜圖1.降香對(duì)照藥材;2～4.香丹滴丸;5.缺降香的陰性樣品圖3 香丹滴丸中降香揮發(fā)油的TLC色譜圖

3 丹參酮ⅡA的含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱為Discovery C18；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-磷酸(15∶65∶20∶0.3)；檢測(cè)波為270nm；流速為1.0mL· min-1；柱溫為35℃，HPLC圖見(jiàn)圖4。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA計(jì)算,應(yīng)不低于2 000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含丹參酮ⅡA0.018mg的溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取本品10丸，研細(xì)，取約0.25g，精密稱(chēng)定，置25mL量瓶中，加甲醇溶液，超聲處理10min，放冷至室溫，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò),即得。

A.陰性對(duì)照品 B.丹參酮ⅡA對(duì)照品 C.香丹滴丸圖4 陰性對(duì)照、丹參酮ⅡA對(duì)照品、香丹滴丸的HPLC圖

3.4 陰性對(duì)照液的制備

陰性對(duì)照液的制備：丹參先以10倍量的0.01mol·L-1鹽酸溶液滲漉，收集滲漉液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.15(60℃)，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置24h，取上清液，備用；藥渣繼續(xù)用10倍量的95%乙醇滲漉，滲漉液濾過(guò)，濾液與上述上清液合并，減壓濃縮并干燥，粉碎，即得丹參提取物。

取丹參提取物0.15g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加0.01mol·L-1鹽酸溶液10mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾器與殘?jiān)?.01mol·L-1鹽酸溶液10mL洗滌，濾液與洗液合并，置50mL量瓶中，加入處方量的聚乙二醇4000、聚乙二醇6000及降香揮發(fā)油，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò),即得。

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取102μg·mL-1丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取20μL溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=104 009X+85 646，r=0.999 9。結(jié)果表明,丹參酮ⅡA濃度在2.6～81.6μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試品溶液20μL，依上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.28%。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD=1.06%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批供試品，按上述測(cè)定方法重復(fù)檢測(cè)6次，測(cè)得本品丹參酮ⅡA平均含量為2.21mg·g-1，即0.12mg/丸，RSD=1.43%，表明本法的重現(xiàn)性良好。

3.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取同一批已知丹參酮ⅡA適量的香丹滴丸細(xì)粉，精密稱(chēng)取6份，分別準(zhǔn)確加入同量的對(duì)照品，各份均按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率試驗(yàn)

注：丹參酮ⅡA照品加入量均為0.225mg

4 丹酚酸B的含量測(cè)定

4.1 色譜條件

色譜柱為Discovery C18；流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸(22∶78∶1.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm；流速為0.7mL·min-1；柱溫為35℃。HPLC圖見(jiàn)圖5。理論塔板數(shù)按丹參酚酸B計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。

A. 陰性對(duì)照品 B. 丹酚酸B對(duì)照品 C.香丹滴丸圖5 陰性對(duì)照品、丹酚酸B對(duì)照品、香丹滴丸的HPLC圖

4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含丹參酚酸B0.20mg的溶液。

4.3 供試品溶液的制備

取本品10丸，研細(xì)，取約0.5g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加0.01mol·L-1鹽酸溶液25mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液置50mL量瓶中，濾器與殘?jiān)眠m量0.01mol·L-1鹽酸溶液分次洗滌，洗液與濾液合并，加0.01mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

4.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

取丹參提取物0.15g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加0.01mol·L-1鹽酸溶液25mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾器與殘?jiān)?.01mol·L-1鹽酸溶液25mL分次洗滌，棄去濾液，濾渣加20mL甲醇溶解，加入處方量的聚乙二醇4000、聚乙二醇6000及降香揮發(fā)油，置50mL量瓶中，加0.01mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

4.5 線性關(guān)系考察

精密吸取2.004mg·mL-1丹酚酸B對(duì)照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL分別置10mL量瓶中，加0.01mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=33 169X+2×106，r=0.999 6。結(jié)果表明，丹酚酸B濃度在50～800μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

4.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試品溶液20μL，依上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果其RSD=0.72%。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0,2,4,8,16,24h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD=0.38%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

4.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批供試品，按上述測(cè)定方法重復(fù)檢測(cè)6次，測(cè)得本品丹酚酸B平均含量為23.5mg·g-1，即1.29mg/丸，RSD=1.34%，表明本法的重現(xiàn)性良好。

4.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取同一批已知丹酚酸B含量的香丹滴丸細(xì)粉，精密稱(chēng)取6份，分別準(zhǔn)確加入同量的對(duì)照品，各份均按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)

注：丹酚酸B對(duì)照品加入量均為4.47mg

5 樣品含量測(cè)定

按供試品制備及含量測(cè)定方法測(cè)定了091006，091008，091010 3批香丹滴丸樣品，丹參酮ⅡA的含量分別為1.27，1.17，1.21mg/丸，丹酚酸B的含量分別為0.12，0.09，0.11mg/丸。

6 討論

采用HPLC分別對(duì)丹參酮ⅡA和丹酚酸B進(jìn)行含量測(cè)定，在方法學(xué)研究中，為了避免丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)彼此色譜條件的影響，故在陰性對(duì)照液的制備中選用丹參提取物而不選用去除丹參的空白滴丸。由兩陰性對(duì)照液HPLC圖可以看出，丹參酮ⅡA陰性對(duì)照液色譜圖中只有一雜質(zhì)峰(2.9min)，在對(duì)照品相應(yīng)位置(13.0min)上沒(méi)有吸收峰，丹酚酸B陰性對(duì)照液色譜圖中沒(méi)有吸收峰，且在兩供試品溶液HPLC圖中主峰與雜質(zhì)峰均能達(dá)到完全分離，即兩色譜條件用于有效成分的含量測(cè)定具有良好的可行性。

[1] 李燕梅.冠心丹參滴丸臨床應(yīng)用體會(huì)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2002，9(5)：269.

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[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄37.

QualityStandardforXiangdanDroppingPills

Li Min1, Lei Qingzhong2, Li Guisheng, Li Yantuan1

(1.OceanUniversityofChina,QingdaoShandong266003,China； 2.ShandongEngineeringResearchCenterforNaturalDrugs,YantaiShandong264003,China)

Objective: To establish the quality standard for Xiangdan Dropping Pills.Methods:Dalbergiaodorifera,Salviamiltiorrhizaof Xiangdan Dropping Pills were identified by TLC. The contents of

tanshinoneⅡAand salvia acid B were determined by HPLC. Methyl-methanol-water-phosphoric-acid (15∶65∶20∶0.3) and methyl-water-methanoic-acid(22∶78∶1.5) were used as mobile phase respectively.Results:Dalbergiaodorifera,Salviamiltiorrhizacan be identified by TLC.The calibration curves of tanshinoneⅡAwas linear within 2.6～81.6μg·mL-1.The average recovery was 99.19%,RSD was 1.34%.The calibration curves of salvia acid B was linear within 50～800μg·mL-1.The average recovery was 98.84%, RSD was 1.74%.Conclusion: The method is simple, accurate and reliable. It can be used for quality control of Xiangdan Dropping Pills.

Xiangdan Dropping Pills; HPLC; TLC; TanshinoneⅡA; Salvia acid B

*李敏，E-mail：limin@luye-pharm.com

2010-03-29)