相思子毒素單克隆抗體的制備純化及鑒定

張立營，趙懷龍，馬鳳龍，傅興倫，孫英姿，高 波

相思子毒素是從豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的種子中提取的一種劇毒性高分子蛋白毒素，其含量約占種子2.8%～3.0%。小鼠的LD50為0.04 μg/kg，成年人攝入的致死劑量為 5.0～7.0 μg/kg，其毒性強度是蓖麻毒素（小鼠LD503.0 μg/kg）的70多倍，已被列為潛在的重要毒素戰劑和生物恐怖病原物質之一[1-4]。

國外已有報道恐怖分子用相思子毒素作為恐怖襲擊的手段。美國陸軍醫學研究發展總部早在1991年對相思子毒素單克隆抗體進行研究和應用，而國內未見相關報道[5-8]。因此，無論是從國際生物武器核查角度，還是從防護目的，開展對相思子毒素的檢測研究都具有十分重要的現實意義。

本實驗應用相思子毒素毒蛋白免疫BALB/c小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，并對其進行了鑒定。擬為發展高靈敏度的相思子毒素檢測試劑盒奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 相思子毒素、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、BALB/c小鼠、Sp2/0骨髓瘤細胞系由北京軍事醫學科學院微生物所提供。胎牛血清、1640培養基為Gibco公司產品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；Protein A-Sepharose CL-4B為GE公司產品。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠的抗原免疫 利用甲醛處理的相思子毒素毒蛋白作為抗原，經腹腔注射免疫10只雌性BALB/c小鼠。初次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原，3周后用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行第2次免疫，再過3周同樣用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行第3次免疫，3次免疫劑量均為100μg/只。每次免疫3次后后段尾靜脈采血，用間接ELISA方法檢測血清中的抗體效價，觀測免疫效果。

1.2.2 雜交瘤細胞的建立 細胞融合前2d用抗原于小鼠尾靜脈加強免疫1次，取小鼠脾細胞與Sp2/0細胞采用50%PEG2000融合按常規方法進行融合。

1.2.3 雜交瘤細胞的篩選與克隆 以10 μg/ml的相思子毒素為包被抗原，用ELISA方法，通過檢測雜交瘤細胞的培養上清篩選陽性融合細胞，再對陽性孔中的細胞以有限稀釋法進行3次細胞克隆，用抗體亞類測定試劑盒對克隆獲得的雜交瘤細胞株進行抗體亞類鑒定。將經過抗體亞類鑒定的單克隆雜交瘤細胞株接種到預處理的BALB/c小鼠腹腔中，制備腹水，并測定其分泌單抗的穩定性。取生長良好，分泌穩定的雜交瘤細胞建株，擴大培養后入液氮保存。

1.2.4 單克隆抗體的效價測定 分別將用不同的單克隆雜交瘤細胞株誘生的小鼠腹水行1/100稀釋，然后再以1/10稀釋率進行梯度稀釋；以相思子毒素為包被抗原，應用間接ELISA方法進行抗體的效價檢測。

1.2.5 單克隆抗體的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應性。各種抗原按5 μg/ml的濃度包被96孔酶標板，同時設陰、陽性對照。

1.2.6 單克隆抗體的純化 應用A蛋白親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。將腹水先通過硫酸銨沉淀進行預處理，然后用ProteinA-Sepharose CL-4B親和層析，通過AKTA explorer100監測純化色譜圖。

1.2.7 單克隆抗體的定量和SDS-PAGE鑒定 將純化獲得的單抗用BCA蛋白定量試劑盒測定抗體的濃度，并推算腹水中單抗的含量，并進行SDSPAGE鑒定

2 結 果

2.1 免疫效果分析 用間接ELISA法對免疫后的小鼠血清抗體效價檢測表明，末次免疫小鼠血清抗體效價均在1∶8000以上，免疫效果良好，可以用于細胞融合。

2.2 雜交瘤細胞株的建立 通過對融合后的雜交瘤細胞培養上清進行檢測和篩選，并對陽性孔中的細胞經過有限稀釋法進行3次細胞克隆，結果顯示細胞融合率為78%，其中陽性細胞孔為8個，陽性率為7.2%。對4株強陽性細胞株進行3次亞克隆后，得到4株單抗細胞株2D3、4E6、1C8和1E5。

2.3 單抗的亞類鑒定 根據抗體亞類測定試劑盒的方法， 分別用抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA試劑包被96孔酶標板，測得2D3細胞株的亞類是 IgG1，4E6、1C8和 1E5細胞株的亞類均為Ig2b。

2.4 單抗的效價測定 用間接ELISA法分別對2D3、4E6、1C8和1E5雜交瘤細胞誘生的腹水進行效價測定，分別為 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106。

2.5 單抗的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應性。結果表明，4株單抗與幾種毒素均無交叉反應，說明所篩選出的單克隆抗體是特異的。

2.6 單克隆抗體的純化 AKTA explorer100監測的純化色譜圖顯示，2D3細胞誘生的腹水經蛋白A親和層析純化，獲得了單一的蛋白洗脫峰（圖1）。通過BCA蛋白定量試劑盒對純化抗體進行定量測定，推算出腹水中單抗含量約為4.6 mg/ml。

圖1 Protein A-Sepharose CL-4B層析圖

2.7 單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定 純化的單抗進行還原性SDS-PAGE電泳，結果顯示：5倍稀釋腹水的SDS-PAGE結果為多條帶，純化后的IgG只有2條帶，上下2條帶分別為IgG的重鏈及輕鏈（圖2），分子量分別是 50、26 kDa，與理論值相符合。

圖2 純化單抗的SDS-PAGE鑒定結果

3 討 論

相思子毒素 （abrin）是存在于豆科植物相思（Abrus precatorius）種子中的一種毒蛋白，與蓖麻毒素（ricin）同為Ⅱ型核糖體失活蛋白（RIP）家族成員，是迄今為止所發現的毒性最強的植物毒素之一，毒性是普通化學武器的幾百倍。從第一次世界大戰起，經美、英、加、法等國的研究，相思子毒素已經成為一個成功的天然毒素戰劑[9，10]。

相思子毒素天然資源比較豐富，制備比較容易，并且借助當今高度發達的生物工程技術手段，還能夠實現大批量生產。相思子毒素中毒后無特異癥狀，出現癥狀時已經造成機體嚴重的器質性損害，給中毒的治療及預防帶來極大的難度，具備生物毒素武器典型特征，因此歷來為外軍所高度重視[3]。在2001年世界生物及毒素武器大會（BTWC）上，相思子毒素再次被列入重點核查清單，因此開展對相思子毒素的研究具有十分重要的意義[11，12]。

本研究利用相思子毒素免疫BALB/C小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，其與相思子毒素、蒴蓮根毒素無交叉反應，表明此株單抗特異性較強，具備建立檢測試劑盒的可能，可作為檢測相思子毒素的核心試劑。

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