HPLC測定天佛參口服液中蟾酥的含量

王芳，張秋萍，吳翰昱

（常熟雷允上制藥有限公司，江蘇 常熟 215500）

HPLC測定天佛參口服液中蟾酥的含量

王芳，張秋萍*，吳翰昱

（常熟雷允上制藥有限公司，江蘇 常熟 215500）

目的：建立HPLC同時測定天佛參口服液中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。方法：采用Waters SymmetryShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（38∶62）為流動相；檢測波長為296 nm；流速為1.0 mL·min－1。結果：在建立的色譜條件下，華蟾酥毒基的回歸方程為Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明華蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg與峰面積積分值呈良好線性關系；脂蟾毒配基的回歸方程為Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg與峰面積積分值呈良好線性關系。結論：本法簡便、快捷，準確度高，專屬性強，重現性好，可用于華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測定。

HPLC；華蟾酥毒基；脂蟾毒配基；含量測定

天佛參口服液是常熟雷允上制藥有限公司研發并已被批準生產的新品種，在含量測定中需要檢測西洋參和蟾酥的含量，其中，檢測蟾酥含量時，需要檢測華蟾酥毒基和脂蟾毒配基兩個成分。法定質量標準YBZ08752008中，采用高效液相色譜法測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，但其介紹的流動相在實際使用中分離度較差，重現性也不是很穩定。歷來文獻中也有對制劑中蟾酥含量測定的報道［1-2］，本文對天佛參口服液法定質量標準中的流動相進行了調整，對柱溫進行調節，使華蟾酥毒基和脂蟾毒配基能夠完全分離，且分離時間較合理。實驗結果表明，本法簡便、快捷，準確度高，專屬性強，重現性好，可用于華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2487-1525-1500高效液相色譜儀。

1.2 試藥

華蟾酥毒基對照品、脂蟾毒配基對照品（中國藥品生物制品檢定所）；天佛參口服液（自制，批號0911141，0911161，0911181）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯甲烷、無水硫酸鈉、無水乙醇為分析純；水為純化水；甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（38∶62）；柱溫：40℃；檢測波長：296 nm；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：20μL。理論塔板數按華蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰計算應分別不低于4 000，實際測量值分別為7 893，8 920。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h的華蟾酥毒基對照品、脂蟾毒配基對照品各適量，加甲醇配制成每1mL含華蟾酥毒基10μg、脂蟾毒配基50μg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品25 mL，置分液漏斗中，加水25 mL，混勻，加三氯甲烷提取5次（30，30，30，20，20 mL），合并三氯甲烷液，用氫氧化鈉溶液（0.1 mol·L－1）50 mL洗滌1次，棄去氫氧化鈉液，再用水50 mL洗滌1次，棄去水液，三氯甲烷液用適量無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方量，制備不含華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的空白樣品，照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.5 系統適應性試驗

分別取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各20μL，按照上述色譜條件進樣測定，結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有一致的色譜峰，陰性溶液在與對照品溶液相同的保留時間處無吸收峰，見圖1。

圖1 對照品及供試品HPLC圖

2.6 線性關系考察

精密量取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基混合溶液3 m L，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進樣1，2，5，10，15，30，50μL，記錄色譜圖，計算峰面積，以峰面積積分值對進樣量進行回歸，求得回歸方程，華蟾酥毒基：Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明華蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg與峰面積積分值呈良好線性關系；脂蟾毒配基：Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.7 穩定性試驗

取樣品溶液（0911141批），在0，4，12，18，24 h時分別進樣5次，記錄峰面積，樣品溶液在24 h內穩定性良好，華蟾酥毒基成分與脂蟾毒配基成分的RSD分別為0.06%和0.31%。

2.8 精密度試驗

取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基對照品溶液，重復進樣7次，記錄峰面積，結果表明華蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好，RSD分別為0.10%和0.06%。

2.9 重復性試驗

取0911141批樣品，按上述色譜條件測定6次，樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量為12.41μg·mL－1，華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的RSD值分別為0.17%和0.15%。

2.10 回收率試驗

分別精密量取樣品（批號0911141）25 mL，共6份，分別精密加入對照品溶液（每1 mL含華蟾酥毒基0.011 6 mg，脂蟾毒配基0.042 1 mg）2，3，4 mL，混勻，加水至50 mL，混勻后，自“加三氯甲烷提取5次”始，按正文中擬定的方法測定，結果見表1，2。

表1 華蟾酥毒基回收率

表2 脂蟾毒配基回收率

2.11 樣品含量測定

分別取3批樣品，按上述方法測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，進行測定，結果見表3。

表3 天佛參口服液樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測定 ／mg·（100mL）－1

3 討論

3.1 流動相的選擇

作者篩選了4種流動相系統，（1）甲醇-水（65∶35），（2）乙腈-水（50∶50）［3］，（3）乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（用磷酸調節pH值為3.2）［4］，（4）乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（38∶62）（用磷酸調節pH值為2.5），并對流動相的pH值進行了考察，結果第4種流動相系統分離效果好，峰形良好，且保留時間適中，故確定上述流動相系統為本法的流動相。

3.2 柱溫的選擇

通過在不同的柱溫條件下進行試驗，發現柱溫40℃時分離度較好，分離時間適中，可保證在正常時間內完成檢測任務。

3.3 提取次數的選擇

在前期試驗過程中，取批號為0911141的樣品，按供試品溶液制備方法，分別以三氯甲烷提取3、4、5次，測定含量。樣品提取3次的峰面積明顯小于提取4、5次，而提取4次和5次的無明顯差別。由此確定樣品提取4次已基本提取完全，故提取次數定為4次。

本文用一個色譜系統同時測定兩個組分的含量，具有簡單、快捷、準確度高、專屬性強、重現性好等特點。因此，可以使用本法用于天佛參口服液中蟾酥含量的質量控制。

［1］王京輝，金偉，金紅宇，等.高效液相色譜法測定蟾酥中有效成分的含量［J］.中國中藥雜志，1998，23（11）：651.

［2］紀玲，王清華，叢保忠，等.高效液相色譜法測定牛黃消炎片中酯蟾毒配基的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，1998，4（1）：2-4.

［3］羅虹，李文，孫麗燕，等.PHLC法測定蟾麝救心丸中蟾酥的含量［J］.光譜實驗室，2005，22（3）：544.

［4］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：360.

Content Determination of Venenum Bufonis in Tianfushen Oral Solution by HPLC

Wang Fang，Zhang Qiuping，Wu Hanyu
（Changshu Leiyunshang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Changshu Jiangsu215500）

Objective：To establish a HPLCmethod to determine the contents of cinobufagin and resibufogenin for chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.Methods：The method were determined by HPLC with Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5μm）as column，amixture of acetonitrile：0.5%potassium dihdyrogen phosphate（38∶62）asmobile phase，UV detector at 296nm and flow rate of 1.0mL·min－1.Results：The calibration curves are linear in the range of 0.013 9～0.695μg for cinobufagin（r＝0.999 0），0.021 0～1.052 5μg（r＝0.999 5）for resibufogenin，respectively.regression equations wereY＝1 000 000X－648.2 andY＝5 000 000X＋42 394，respectively.Conclusion：The method is simple，rapid and accurate，which can be used to determine chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.

HPLC；Cinobufagin；Resibufogenin；Content determination

*張秋萍，E-mail：zqp922＠sina.com

2010-03-01）