夫臺烏藥不同生長年份塊根中波爾定堿的分離與含量測定

王衍彬，童曉青，劉本同，于金慧，錢華

（浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023）

夫臺烏藥不同生長年份塊根中波爾定堿的分離與含量測定

王衍彬，童曉青，劉本同，于金慧，錢華*

（浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023）

目的：測定不同年份和地點的天臺烏藥塊根中所含波爾定堿含量。方法：應用高效液相色譜法測定，色譜柱：XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5μm）鍵合相填充柱；流動相：A相為乙腈，B相為1.5‰三乙胺（用甲醇調節pH至2.5），梯度洗脫，0～20 min，10%～20%A，90%～80%B。柱溫25℃；流速1mL·min－1，檢測波長289 nm。結果：波爾定堿含量以三州鄉6年生為最高，達0.17%；5年生天臺烏藥塊根波爾定堿含量高低次序為三州鄉（0.16%）＞田芯鄉（0.14%）＞永溪鄉（0.10%）＞桐柏鄉（0.06%）。結論：塊根中波爾定堿的含量均與植物的生長發育年齡以及土壤條件有關。

天臺烏藥；波爾定堿；含量

烏藥為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm.的膨大塊根，為傳統常用中藥，重要的理氣止痛藥，具有行氣止痛、溫腎散寒的功能。用于寒凝氣滯，胸腹脹痛，氣逆喘急，膀胱虛冷，遺尿尿頻，疝氣疼痛，經寒腹痛［1］。烏藥主要含有揮發油、異喹啉生物堿及呋喃倍半萜及內酯等化學成分，其中生物堿類成分是烏藥的主要活性成分，現代藥理學研究表明其具有廣泛的抗炎和抗關節損壞等藥理活性［2］。20世紀90年代以來，關于烏藥塊根化學成分的分析，主要集中在揮發油以及倍半萜類成分［3-4］，近年來發現烏藥塊根含有多種異喹啉類生物堿，其含量、種類以及生物活性已有研究報道［5］。其中，有學者建議選擇去甲異波爾定作為測定烏藥質量的指標成分，也有選擇波爾定、降波爾定、網狀香荔枝堿和 Linderegatine作為指標成分［6-7］。有研究表明，異喹啉類生物堿中，波爾定堿抗氧化活性是異波爾丁堿的2倍，這表明異喹啉類生物堿的構效關系對其生物活性的影響至關重要［8-9］。鑒于此，本實驗在烏藥塊根所含的4種異喹啉類生物堿中，選擇波爾定堿作為含量測定的指標，采用高效液相色譜法對天臺烏藥塊根在同一地點不同年份以及同一年份不同地點的波爾定堿含量進行測定，為天臺烏藥的質量控制提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters600高效液相色譜儀；2489型紫外可見檢測器；XBridge C18色譜柱；BSA224s-cw賽多利斯分析天平，精度0.1 mg。

1.2 材料

2～6年生天臺烏藥塊根分別采自浙江省天臺縣三州鄉、田芯鄉、永溪鄉、桐柏鄉，經浙江省林業科學研究院植物分類專家洪利興研究員鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm.的塊根。洗凈陰干后，置－25℃冰箱保存。塊根的年齡采用徒手切片法制備樣品橫切薄片，置玻片上用倒置光源觀察，根據纖維束環帶的數目確定其年齡。波爾定堿對照品（Sigma，純度為98%），甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA公司），三乙胺（分析純，成都市科龍化工試劑廠），Millipore超純水。

供試土壤于2009年5月采自浙江省天臺縣，選擇了天臺烏藥產量較多的東、南、西、北4個樣地的天然林地土樣，分別為永溪鄉（N 29°08′18.8″，E 121°10′58.2″），海拔 400 m；田芯鄉（N 29°03′36.5″，E 120°42′46.3″），海拔 403 m；三州鄉（N 29°12′59.7″，E 120°48′29.1″），海拔 274m；桐柏鎮（N29°12′41.4″，E 121°00′31.8″），海拔 435 m。表層土壤樣品的采樣深度為10 cm，研究區內土壤類型主要以山地黃壤土為主，每個樣地設3個重復。土壤采回后自然風干，然后粉碎，分別過20目和100目尼龍篩，供分析用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈為A相，1.5‰三乙胺（用醋酸調節pH至2.5）為B相，梯度洗脫，0～20 min，10%～20%A，90%～80%B。柱溫：25℃；流速：1 mL·min－1，檢測波長：289 nm，進樣量：10μL［6-7］。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取波爾定堿對照品適量，加甲醇配成每1 mL中含波爾定堿0.985 mg的溶液，搖勻，即得。

2.3 線性關系考察

取波爾定堿對照品98.5 mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液轉移至10mL容量瓶中，作倍比稀釋，分別加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.006 2，0.012 3，0.024 6，0.049 3，0.098 5mg·mL－1的對照品溶液。準確吸取上述對照品溶液10μL，按上述確定的色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算得回歸方程為Y＝6X＋16.04，r＝0.999 4，說明波爾定堿進樣量在0.06 2～0.98 5μg具有良好的線性關系。

2.4 供試品溶液的制備

準確稱取同一地點（三州）采集的2～6年生天臺烏藥塊根樣品粉末0.1 g，精確到0.000 1 g，置100 mL具塞三角燒瓶中，加入甲醇10 mL，浸泡40 min，超聲處理2次，每次20 min，超聲頻率40 Hz，功率120W。第一次超聲后，放冷過濾，將濾渣再加10 mL甲醇后超聲。合并2次濾液，減壓回收溶劑，提取物浸膏用1 mL甲醇溶解后移入5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，0.45μm濾膜過濾即得。按上述同法制備從4個地點采集的5年生天臺烏藥塊根樣品的供試品溶液。

2.5 精密度試驗

取4年生烏藥樣品1份，連續進樣6次，按照峰面積計算RSD＝0.11%，表明儀器性能穩定。

2.6 穩定性試驗

取4年生烏藥樣品1份，分別在0，4，8，16，24，48 h進行分析，測定波爾定堿，以峰面積計算RSD＝1.2%，表明供試樣品溶液在48 h內是穩定的。

2.7 加樣回收率試驗

平行取6份4年生烏藥樣品，每份0.2 g，分別加入0.225 0 mg波爾定堿標準樣品溶液，按照2.4的樣品制備方法，制備供試樣品溶液并測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 波爾定堿加樣回收率

2.8 樣品含量測定

分別精密吸取樣品及對照品溶液各10μL，按照上述測定條件，分別測定同一地點不同年份以及同一年份不同地點的天臺烏藥樣品，每個批次平行3份，每份樣品平行進樣2次，以外標法計算樣品中波爾定堿的含量，結果見表2、3。樣品和對照品HPLC圖見圖1。根據結果計算理論塔板數和分離度分別為880和1.38，基本達到分離效果。

表2 同一地點不同生長年份天臺烏藥塊根中波爾定堿的含量測定

表3 同一年份不同地點的天臺烏藥塊根中波爾定堿的含量測定

2.9 土壤主要營養成分分析

土壤全氮采用半微量凱氏定氮法，速效氮采用蒸餾法；土壤全磷采用高氯酸－硫酸酸溶－鋁銻比色法，速效磷采用碳酸氫鈉法；土壤全鉀采用火焰光度法，速效鉀采用1 mol·L－1NH4OAC浸提－火焰光度法。土壤pH值采用pH計測定；土壤有機質的測定采用重鉻酸鉀法。測試結果見表4。

表4 天臺烏藥不同樣地土壤主要營養成分分析

圖1 波爾定堿對照品及樣品HPLC圖

3 討論

由于近年來野生天臺烏藥資源被大量采挖，目前已經很少能采集到6年生以上的烏藥塊根。根據本實驗對當地所采集的烏藥樣品的分析統計，其中大部分為4～5年生，占85.7%，由于1年生的天臺烏藥還尚未形成塊根，2年生以上的才形成塊根，因此本實驗只測定了2～6年生的烏藥樣品。如表2、圖1所示，天臺烏藥塊根中波爾定堿的含量與塊根的生長發育年齡有關，從表2可以看出，其含量隨生長年份的增大而增加。對波爾定堿的含量分析表明，天臺烏藥的最佳采收期應在6年以上。根據浙江省地方標準《地理標志產品——天臺烏藥》的規定，天臺烏藥的采集時間應為6～8年，可見是有一定依據的。

天臺烏藥波爾定堿的含量也與生長環境有關，盡管天臺縣全境內產的烏藥都屬于地理標志產品保護的范圍，但來源于不同鄉鎮的天臺烏藥波爾定堿的含量確實存在一定的差異，從表3可以看出，5年生的天臺烏藥塊根，其波爾定堿的含量以三州鄉為最高，田芯鄉其次，而三州鄉的土壤N、P、K養分明顯較其他鄉鎮為高。天臺烏藥在天臺分布很廣，基本上每個鄉鎮都有，特別是天臺縣的三州、平橋、街頭、龍溪、石梁、華峰等地分布最為集中，產量也最大。而天臺縣不同區域之間烏藥質量的相對比較值得探討，這對指導今后發展天臺烏藥規模化人工栽培區域的合理布局具有積極的意義。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：71-72.

［2］王禪，戴岳，侴桂新，等.烏藥總生物堿對大鼠佐劑關節炎的影響及其機制研究［J］.中國藥理與臨床，2006，22（3）：63.

［3］杜志謙，夏華玲，江海肖.烏藥揮發油化學成分的GC／MS分析［J］.中草藥，2003，34（4）：308.

［4］程顯隆，魏鋒，馮玉飛.RP-HPLC法測定烏藥中烏藥醚內酯和烏藥內酯的含量［J］.藥物分析雜志，2003，23（3）：225.

［5］侴桂新，中村意夫，馬超美，等.烏藥中異喹啉類生物堿［J］.中國天然藥物，2005，3（5）：272-275.

［6］陳建忠，侴桂新，楊莉，等.烏藥中異喹啉生物堿去甲異波爾定的含量測定［J］.中國中藥雜志，2009，34（21）：21-23.

［7］韓錚，蘇慧麗，陳娜，等.高效液相色譜法同時測定烏藥中的4種生物堿［J］.中國中藥雜志，2009，34（5）：583.

［8］程軒軒，王冬梅，楊得坡.異喹啉類生物堿的生物活性和構效關系研究進展［J］.中草藥，2006，37（12）：1900-1904.

［9］ Brien P.，Pozo C C.，Speisky H.Boldine and its antioxidantor health-promoting properties［J］.Chem Biol Interact，2006，159（1）：1-17.

Study on the Content of Boldine from Different Ages of Tiantai Linderae Radix Earthnut

Wang Yanbin，Tong Xiaoqin，Liu Bentong，Yu Jinhui，Qian Hua
（Zhejiang Academy of Forestry Sciences，Hangzhou Zhejiang310023，China）

Objective：To determine the contents of boldine from different ages and areas of Tiantai linderae radix earthnut.Methods：The HPLC method was established by XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm），using A phase of acetonitrile and B phase of 1.5‰ triethylamine（adjust pH to 2.5 with acetic acid）with gradient elution（0～20min，10% ～20%A，90%～80%B）as mobile phase，ata flow rate of1mL·min－1，a temperature of25℃and detected wavelength of 289 nm.Results：The highest content of boldine in Tiantai linderae radix earthnut which was 6 years old from Sanzhou was 0.17%，the contents of one in which was 5 years old was follow as：Sanzhou（0.16%）＞Tianxin（0.14%）＞Yongxi（0.10%）＞Tongbo（0.06%）.Conclusion：The results showed that the content of boldine was correlated with the age and area of Tiantai linderae radix earthnut.

Tiantai linderae radix earthnut；Boldine；Content

*錢華，E-mail：qianhua18＠126.com

2010-04-19）