柳穿魚黃酮類成分的提取工藝優(yōu)化

蘭洲，田鐵輝，關(guān)紅峰，華會明，劉曉秋*

（1.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學高職學院，遼寧 沈陽 110032）

柳穿魚黃酮類成分的提取工藝優(yōu)化

蘭洲1，田鐵輝2，關(guān)紅峰1，華會明1，劉曉秋1*

（1.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學高職學院，遼寧 沈陽 110032）

目的：優(yōu)化柳穿魚中黃酮類成分的提取工藝。方法：采用正交試驗方法，以分光光度法測定總黃酮的含量和HPLC法測定柳穿魚苷的含量為指標，確定柳穿魚中黃酮類成分的提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為80%乙醇8倍量，回流提取2次，每次1 h。結(jié)論：此提取工藝合理可行，為柳穿魚的進一步研究提供參考。

柳穿魚；黃酮；提取工藝；分光光度法；HPLC

柳穿魚為玄參科（Scrophlariaceae）植物柳穿魚Linaria vulgarissubsp.sinensis（Bebeaux）Hong的干燥全草。具有清熱解毒，散瘀消腫之功效。該植物的化學成分有黃酮類［1］、環(huán)烯醚萜苷類［2］、生物堿類［3］、三萜類［4］等。民間主要用于黃疸、頭痛、頭暈、痔瘡便秘、皮膚病和燙傷［5］。其主要成分為黃酮類化合物，具有抗炎、降血壓、抗癌、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性［6-9］。黃酮類成分中含有柳穿魚苷、蒙花苷、乙酰蒙花苷、柳穿魚苷元、刺槐素、木犀草素、香葉木素、白楊素［1］，其中柳穿魚苷為黃酮類的主要成分［10-12］。目前，尚沒有關(guān)于柳穿魚黃酮提取工藝的報道，本文以HPLC測定柳穿魚苷的含量和分光光度法測定總黃酮的含量為指標，通過正交設計優(yōu)選黃酮類成分的提取工藝，為柳穿魚的開發(fā)和合理利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

UV-2100紫外分光光度計（日本島津公司），RE5-CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），高效液相色譜儀（LC-10Atvp泵、DAD檢測器、CLASS-VP工作站，日本Shimadzu公司）。Diamonsil ODSC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，北京迪馬科技公司）。

柳穿魚藥材于2008年9月采自哈爾濱江北郊區(qū)，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學院喬俊纏教授鑒定為柳穿魚Linaria vulgarissubsp.sinensis（Bebeaux）Hong的干燥全草。柳穿魚苷（本實驗室自制，純度為99.2%）。柳穿魚苷對照品（純度質(zhì)量分數(shù)＞98%，自制），乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），甲醇（色譜純，天津康科德科技有限公司），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其他試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 分光光度法測定總黃酮的含量

2.1.1 對照品溶液的制備 取柳穿魚苷對照品約5 mg，精密稱定。加80%乙醇制成每1 mL含0.212 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取藥材約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，精密吸取上清液1mL，置25mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 測定波長的選擇 精密量取供試品溶液和對照品溶液適量，在200～400 nm對供試品溶液和對照品溶液掃描，供試品和對照品均在330 nm處有最大吸收，故確定330 nm為測定波長。

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取 “2.1.1”項下的柳穿魚苷對照溶液 0.2，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，加80%乙醇至10mL，搖勻，于330 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，對照品量（X）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程A＝4.450×10－2X＋8.500×10－3，r＝0.999 1（n＝5）。表明柳穿魚苷在4.24～14.84μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取同一批藥材約0.5 g，精密稱定，按 “2.1.2”制備供試品溶液。取溶液分別在330 nm波長處重復測定5次，測得5次吸光度平均值為0.306，RSD＝1.0%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取 “2.1.5精密度試驗”項下的供試品溶液，在0，2，4，8，12 h測定吸光度，測得5次吸光度平均值為0.309，RSD＝1.5%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 分別取同批藥材6份，各約0.5 g，精密稱定，按 “2.1.2”制備供試品溶液。取溶液分別在330 nm波長處測定吸光度，計算總黃酮的含量，測得平均含量為2.8%，RSD＝2.6%。表明重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的1號藥材粉末約0.25 g，精密稱定，加入適量的柳穿魚苷對照品約3.7 mg。按 “2.1.2”制備供試品溶液。取溶液在330 nm下測定吸光度，計算總黃酮含量，平均回收率為98.9%，RSD＝3.0%。

2.1.9 樣品的測定 取3批藥材適量，按照“2.1.2”制備供試品溶液，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算藥材中總黃酮的量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總黃酮的含量分別為2.92%，2.91%，2.81%。

2.2 HPLC測定柳穿魚苷的含量

2.2.1 供試品溶液的制備 取藥材約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加體積分數(shù)為80%的乙醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，取濾液10 mL，濃縮至5 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.2 樣品的測定 取 “2.2.1”項下供試品溶液，按照文獻［13］所建立的HPLC方法，對柳穿魚苷進行含量測定。結(jié)果表明，3批藥材柳穿魚苷的含量分別為1.52%，1.50%，1.45%。

2.3 正交試驗因素水平的確定

根據(jù)單因素分析結(jié)果和實際情況，對提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、溶劑倍量（C）及乙醇濃度（D）4個因素進行考察，每個因素選擇3個水平，采用L9（34）正交表安排試驗，以柳穿魚中總黃酮和柳穿魚苷含量為考察指標，因素水平安排見表1。

表1 柳穿魚總黃酮提取工藝正交試驗因素水平表

2.4 正交試驗結(jié)果

按照 “2.1”項下及 “2.2”項下方法操作，以總黃酮和柳穿魚苷含量為指標，計算結(jié)果及進一步的方差分析分別見表2和表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

由表2直觀分析結(jié)果表明，以總黃酮成分含量為指標，各因素對指標成分的提取率的影響依次為B＞D＞A＞C，最佳工藝為A3B2C3D3；以柳穿魚苷的含量為指標，各因素對指標成分的提取率的影響依次為D＞B＞A＞C，最佳工藝為A3B2C2D3。

由表3方差分析結(jié)果表明，B因素（提取次數(shù)）和D因素（乙醇濃度）對總黃酮提取率有影響（P＜0.1），對柳穿魚苷的提取率則有顯著性影響（P＜0.05）。而A因素（提取時間）和C因素（溶劑倍量）因素的影響不大，對于A因素，結(jié)合直觀分析可選擇A2（60 min）；對于C因素（溶劑倍量），從節(jié)約溶劑的角度考慮，可選擇C2（8倍量）。最后確定工藝工藝為A2B2C2D3。

2.5 試驗結(jié)果驗證

取3份藥材各約10 g，精密稱定。按A2B2C2D3提取，即80%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，測得的總黃酮與柳穿魚苷量分別為23.8，9.2 g·kg－1；25.5，11.7 g·kg－1；24.6，10.5 g·kg－1；與預測值基本一致，結(jié)果表明該提取工藝較合理。

3 討論

根據(jù)文獻報道，柳穿魚中主要的黃酮類成分為柳穿魚苷、蒙花苷、乙酰蒙花苷、刺槐素和柳穿魚苷元等，紫外最大吸收波長分別都在270 nm和330 nm附近，而其中環(huán)烯迷萜苷類、生物堿類和三萜類成分在此波長下均無紫外吸收，因此對總黃酮及柳穿魚苷的測定均不產(chǎn)生干擾。

柳穿魚中主要的黃酮類成分柳穿魚苷、蒙花苷等在水、甲醇及乙醇中溶解性較差，而易溶于熱甲醇和熱乙醇中，因此采用加熱回流提取法進行回流提取。

［1］華會明，孫軍，李銑.柳穿魚黃酮成分的研究［J］.中藥材，1999，30（5）：332-334.

［2］Esposito P，ScarpatiM L.IridoidⅨ 10-O-β-glucosil-aucubia dallaLinaria vulgaris［J］.Gazz Chim Ital，1970，100：836-845.

［3］華會明，樸奉花，王素賢，等.柳穿魚新生物堿的研究［J］.沈陽藥科大學學報，1997，14（3）：219.

［4］華會明，侯柏玲，李文，等.柳穿魚中三萜類化合物的研究［J］.中草藥，2000，31（6）：409-412.

［5］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典（下冊）［M］.上海：上海人民出版社，1977：1526.

［6］ Esther Del Olmo， Arturo San Feliciano.Chem ical Constituents of Linaria aucheri［J］.Turk JChem，2004，28：133-139.

［7］Hyun LIM，Kun Ho SON，Hyeun Wook CHANG，et al.Anti－inflammatory Activity of Pectolinarigenin and Pectolinarin Isolated fromCirsium chanroenicum［J］.Biol.Pharm.Bull，2008，31：2063-2067.

［8］Rosa Tundis，Brigitte Deguin，Monica R.Loizzo，et al.Potential antitumor agents：Flavones and their derivatives fromLinaria reflexaDesf［J］.Med.Chem.Lett，2005，15：4757-4760.

［9］Monica Rosa Loizzoa，Rosa Tundis，F(xiàn)ederica Menichini，et al.Acetyl-cholinesterase Inhibition by Extracts and Isolated Flavones fromLinaria reflexaDesf.（Scrophulariaceae）［J］.Nat.Prod.Com，2007，2：759-763.

［10］VALDE’S B.Flavonoid pigments in flower and leaf of the genusLinaria（Scrophulariaceae）［J］.Phytochem，1970，9：1253-1260.

［11］Hua Huim ing，Cheng Maosheng，Li Xian，et al.A new phyrroloquinazoline alkaloid fromLinaria vulgaris［J］.Chem Pharm Bull，2002，50（10）：1393-1394.

［12］EMI IA I，NEDJALKA H，SIMEON S.Iridoid glucosides fromLinaria vulgaris［J］.Phtochem，1992，31（3）：1040-1041.

［13］關(guān)宏峰，劉曉秋，蘭洲，等.HPLC法同時測定中藥柳穿魚中柳穿魚苷和橙皮苷的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2009，26（2）：119-122.

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Linaria Vulgaris

Lan Zhou1，Tian Tiehui2，Guan Hongfeng1，Hua Huiming1，Liu Xiaoqiu1
（1.School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110016，China；2.Higher Vocational Technology College of Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110032，China）

Objective：To optimize the conditions for extraction of flavonids fromLinaria vulgaris.Methods：The extraction conditions were studied by the orthogonal design with the content of total flavonoids and pectolinarin as indexes.Results：The optimum conditions were as follows Adding 8 times amount of 80%（V∶V）ethanol，and extracting for two times，1 h each times.Conclusion：The optimized method is reasonable and feasible for flavonids fromLinaria vulgarisssp.sinensis，and can provide a reference for further research.

Linaria vulgaris；Flavonoids；Extraction process；Spectrophotometry；HPLC

*劉曉秋，E－mail：liuxiaoqiu3388＠tom.com

2010-05-18）