未修飾碳納米管的細胞毒性機理及其影響因素

劉元方, 劉佳蕙, 王海芳

(1.上海大學納米化學與生物學研究所,上海 200444;2.北京大學化學與分子工程學院,北京 100871)

未修飾碳納米管的細胞毒性機理及其影響因素

劉元方1,2, 劉佳蕙1,2, 王海芳1

(1.上海大學納米化學與生物學研究所,上海 200444;2.北京大學化學與分子工程學院,北京 100871)

隨著碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)制備技術的成熟和潛在應用的開發,CNTs的毒性也逐漸引起人們的重視.就未修飾 CNTs而言,目前已有大量的文獻報道了它們的細胞毒性的效果、機理、影響因素等.一種觀點認為,CNTs通過影響細胞粘附、細胞周期或引起細胞內氧化應激水平的提高等手段,導致細胞發生凋亡,存活率下降.但也有一些研究發現,CNTs具有較高的生物安全性,沒有顯著的細胞毒性.存在對立的實驗結果的主要原因是影響CNTs細胞毒性的因素很多.CNTs雜質的種類和含量、純化方法不同,細胞培養環境的不同甚至生物終點檢測方法的不同,都會影響對 CNTs細胞毒性的判斷.CNTs本身的性質,包括長度 /直徑、分散性等也都影響著 CNTs的細胞毒性.為了更準確地評估 CNTs的細胞毒性,建立標準樣品,統一檢測方法勢在必行,即建立 CNTs標準品和暴露劑量標準,發展適合 CNTs的細胞毒性檢測方法.歸納總結了以上各方面的研究成果,對今后的相關研究提出看法和建議.

碳納米管;細胞毒性;氧化應激

Abstract:With the development of production and application of carbon nanotubes(CNTs),the toxicity of CNTs has attracted much research attention.Cytotoxicity of p ristine CNTs and its mechanism and influencing factors have been widely reported.CNTs are reported to induce cell apoptosis/necrosis and reduce cell viability by influencing cell adhesion,cell cycle p rogressor oxidative stress.On the contrary,some researchers report that CNTs have little effectson cells.The conflicting results come from the fact thatmany chemical and physical p roperties affect cytotoxicity of CNTs,including the impuritiesof CNTs,the purification method,the size of CNTs,aggregation/dispersion of CNTs,cell culture condition,and even analysismethods.It is essential to establish standard reference samp les and detection methods for accurate assessment of the CNTs cytotoxicity.This review summarizes the research achievements on the cytotoxicity of pristine CNTs,and gives the perspective of the future research.

Key words:carbon nanotubes(CNTs);cellular toxicity;oxidative stress

1991年,Iijima在高分辨透射電子顯微鏡下意外觀察到碳納米管 (carbon nanotubes,CNTs)之后,CNTs便成為了最受重視的納米材料之一.CNTs具有典型的層狀中空結構特征,管身由六邊形碳環微結構單元組成,是一種徑向尺寸為納米量級、軸向尺寸為微米量級的一維量子材料.根據管壁層數的差別,CNTs一般分為單壁 CNTs(single-walled CNTs,SWNTs)和 多壁 CNTs(multi-walled CNTs,MWNTs)[1-2].MWNTs在開始形成的時候,層與層之間保持固定的距離,約為 0.34 nm,直徑一般大于2 nm,層與層之間很容易成為陷阱中心而捕獲各種缺陷,因而管壁上通常布滿小洞樣的缺陷.與MWNTs相比,SWNTs是由單層圓柱型石墨層構成,其直徑大小的分布范圍小,缺陷少,具有更高的均勻一致性.由于 CNTs獨特的結構,其研究具有重大的理論意義和潛在的應用價值,如 CNTs具有高拉伸強度、低密度、獨特的電學性質,以及良好的熱穩定性和化學穩定性等多種特性,在電子器件、復合材料等眾多領域有著廣泛的應用前景.在生物學領域,CNTs作為一種高級生物傳感器材料已被實際應用,如抗原識別、酶催化反應和 DNA雜交等;CNTs擁有獨特的一維納米結構,是多種藥物理想的納米載體[3-6];CNTs的復合材料可以作為人造骨骼植入體內,為新生肌肉提供骨架和載體[7-8],并能誘導骨骼細胞的定向分化[9-10];CNTs還可以作為神經生長的基質[8]、多功能生物傳輸器和近紅外射線選擇性殺傷癌細胞的媒介[11]等.

隨著制備技術的成熟和應用潛力的開發,CNTs的產量正逐年增長,人們直接或間接地接觸 CNTs的機會也隨之增加,隨之而來的 CNTs生物安全性也逐漸引起廣泛的重視[12-13].相關毒性研究已經在分子、細胞、組織到整體動物多個層次上展開,獲得了相當多的數據.特別是細胞水平的工作,由于模型簡單,適合機理性的研究,受到了大家的關注.已有大量的文獻就 CNTs細胞毒性的效果、機理和影響因素進行了報道.但是,至今對于 CNTs是否具有細胞毒性仍存在爭議[13-14].一部分研究者認為 CNTs具有毒性,并給出了各種毒性產生的機理;另一部分研究者發現 CNTs沒有細胞毒性.但可以肯定的是,之所以有這樣矛盾的結果,是因為有諸多的外在和內在的因素影響了對 CNTs細胞毒性的判斷.本文將總結歸納 CNTs的細胞生物效應研究結果,探討影響其生物效應的各種因素,在此基礎上對未來CNTs細胞毒性研究提出看法和建議.

1 未修飾碳納米管

未修飾碳納米管 (pristine CNTs)在理論上是指單純、完整的碳納米管結構,在本文中特指經過純化但沒有被化學修飾的 CNTs.研究未修飾 CNTs的細胞毒性有著廣泛的意義.

首先,隨著研發的進步,CNTs的應用范圍越來越廣,產量也隨之逐年增長.CNTs已由實驗室走進人們的生活和環境,未修飾 CNTs已經作為商品流通于市,人們不可避免地會接觸到 CNTs.因而,研究CNTs細胞毒性,對了解其對人類健康和安全的影響提供了重要數據.

其次,雖然 CNTs的各種生物學應用,包括生物傳感器、藥物載體等,往往要求 CNTs經過各種修飾,具備良好的水溶性、生物相容性和特定的生物學功能,但是,這些 CNTs衍生物在各種環境和條件下,可能發生去修飾作用,重新成為未修飾 CNTs.因此,研究未修飾 CNTs的生物效應對 CNTs安全應用于生物醫學領域至關重要.

最后,人們對未修飾 CNTs的各種物理性質的控制也越來越精細.對不同性質未修飾 CNTs的細胞毒性的比較和研究,有利于闡明 CNTs細胞毒性的影響因素和機理.

2 碳納米管對細胞活性和功能的影響

CNTs對細胞的活性和功能可能會產生重要的影響.從 2003年 Shvedova等[15]首次報道了 SWNTs能使人表皮角化細胞活性降低以來,已有大量的文獻采用多種細胞系、多樣的檢測手段,研究了 CNTs的毒性.作為一種碳納米材料,CNTs相對于納米氧化鐵、納米氧化鋅、半導體量子點等納米材料,具有相對較小的毒性和較高的生物相容性[16-17].但是,仍有眾多的實驗數據顯示,在一定條件下,CNTs對細胞的存活率和功能有影響,甚至導致細胞死亡.如圖1所示的研究結果,CNTs能夠降低細胞的粘附能力,提高細胞內氧化應激水平,阻礙細胞周期.通過這些過程,細胞可能會進一步通過凋亡/壞死的途徑走向死亡.在某些情況下,細胞本身并未死亡,但增殖受到了抑制,并在實驗中表現為總細胞活力的降低.

2.1 CNTs對細胞粘附的影響

細胞主要通過細胞粘附分子 (cell adhesion molecule,CAM)介導細胞間或細胞與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)間的相互接觸和結合.細胞正常粘附具有重要的生物學意義:①細胞的粘附影響細胞的存活與生長.正常真核細胞,除成熟血細胞外,大多需粘附于特定的細胞外基質上才能避免凋亡而存活,稱為定著依賴性 (anchorage dependence).例如,上皮細胞及內皮細胞一旦脫離了細胞外基質就會發生凋亡.②細胞粘附決定細胞的形狀.體外實驗證明,各種細胞脫離了細胞外基質呈單個游離狀態時多呈球形.③細胞通過與特定的細胞外基質成分作用而發生分化.例如,成肌細胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型,而在層粘連蛋白上則停止增殖,進行分化,融合為肌管.④參與細胞的遷移.細胞的遷移依賴于細胞的粘附與細胞骨架的組裝,粘著斑是聯系細胞外基質與細胞骨架的“鉚釘”.

2005年,Cui等[18]發現用 SWNTs處理人胚胎腎細胞 HEK293后,細胞的活性減低.他們認為這與經過孵育后,細胞粘附能力明顯降低有關.他們還發現,經過 SWNTs處理后,與細胞粘附相關的細胞因子層粘蛋白、纖連蛋白、粘著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)、鈣粘蛋白和膠原蛋白等的表達都顯著降低.

2006年,Tian等[19]也發現人真皮纖維細胞與SWNTs接觸后細胞活力顯著降低.他們推測 SWNTs產生細胞毒性的機制是:正常細胞通過鈣粘分子等細胞粘附分子介導細胞間或細胞與細胞外基質間的相互接觸和結合,通過細胞骨架支持細胞完整的結構;而 SWNTs能夠干擾細胞膜的結構組成,使細胞粘附相關分子的表達改變;進而細胞骨架斷裂,細胞形態和細胞粘附能力發生改變,最終導致細胞的凋亡或壞死 (見圖2).

圖1 CNTs對細胞的活性和功能的影響Fig.1 Effects of CNTs on the viability and function of cells

圖2 CNTs通過影響細胞的粘附能力產生毒性[19]Fig.2 CNTs induce cytotoxicity by changing the adhesion ability of cells[19]

W?rle-Knirsch等[20]通過免疫染色,在熒光顯微鏡下觀察到 FAK和肌動蛋白在 SWNTs周圍的聚集.FAK是整合蛋白介導的信號轉導中的重要成員,有酪氨酸蛋白激酶活性,并可自身磷酸化;FAK可抑制細胞凋亡,與細胞內其他信號轉導通路存在串話 (crosstalk),直接參與細胞多種功能的調節.在他們的實驗條件下,A549細胞團繞 SWNTs生長,并將 SWNTs包裹起來,形成聚集體,并從培養皿底脫離開來.2008年,Zhang等[21]也研究了 CNTs對 FAK蛋白表達的影響.他們發現:在 SWNTs培養的細胞中,點狀和線狀的 FAK都分布在細胞的邊緣;而在MWNTs培養的細胞中,只有點狀的 FAK存在,并且均勻分布在細胞內.因此,CNTs的引入會影響細胞中 FAK的分布,并且不同種類的 CNTs對 FAK表達的影響也不同.Walker等[22]也觀察到,被 SWNTs或MWNTs孵育后,細胞骨架崩解,鈣粘蛋白減少.

與干擾細胞粘附能力的報道相反,關于細胞能夠在 CNTs復合材料的縫隙中粘附、生長、增殖、分化的報道也有很多[7,9,23-26].2009年,Tutak等[27]細致研究了 SWNTs薄膜對成骨細胞的影響.首先將SWNTs沉積到聚纖維素酯膜上,并在該基底上培養大鼠成骨干細胞.結果發現,細胞與 SWNTs接觸24 h后,能夠吞噬少量的疏松 SWNTs,并引起急性的細胞毒性,誘發細胞死亡.然而,繼續培養該細胞卻發現,殘余的細胞仍具有旺盛的增殖能力.在后續培養的 23 d時間內,細胞數量持續增加,總蛋白含量遠高于在聚苯乙烯基底上生長的對照組細胞.他們認為,SWNTs接觸的急性毒性引起少量的細胞死亡,促進了細胞內源性細胞毒性因子的表達,刺激了細胞的生長.

經過 CNTs的孵育,細胞中粘附相關蛋白的表達和細胞的粘附能力往往會發生變化,但這些變化是否導致 CNTs產生細胞毒性以及機制如何,在目前零散的數據中,還不能有確定的結論.CNTs對粘附相關蛋白的表達水平、粘附相關蛋白的信號通路以及細胞粘附的動力學的影響,包括這些因素對細胞遷移、存活的影響都有待細致地研究.

2.2 CNTs對細胞增殖的影響

2007年,De Nicola等[28]研究了用不同方法制備的、雜質含量有差異的多種MWNTs對 U937細胞的活力及增殖的影響.他們用直接計數法來判斷細胞的增殖,用臺酚蘭拒染實驗測定細胞死亡率,用Hoechst 33342/PI雙染法判斷細胞凋亡.結果發現,在與 25μg/mL的 CNTs孵育 48 h后,細胞的個數相對于對照組顯著減少,即增殖被抑制,但沒有明顯的壞死或凋亡.根據他們的實驗數據,在 CNTs環境下孵育后,細胞增殖能力的改變是一個相對于細胞死亡的早期事件.

2007年,Herzog等[29]利用克隆形成法(clonogenic assay),在三種細胞系 (A549,HaCaT和BEAS-2B)中都觀測到了 CNTs對細胞增殖的影響.Casey等[30]報道的結果與此一致.

CNTs對細胞增殖的影響可以體現在對細胞周期的影響上.細胞周期是指能持續分裂的真核細胞從一次有絲分裂結束后生長,再到下一次分裂結束的循環過程,即細胞增殖一次的過程.細胞周期的長短反映了細胞所處狀態.

研究發現,CNTs能夠通過延滯細胞周期影響細胞的增殖.2005年,Cui等[18]用 SWNTs處理HEK293細胞,發現細胞被阻滯在 G1期,無法正常分裂,進而引發凋亡.相應地,與細胞周期相關的蛋白激酶(CDK)和周期蛋白 (cyclin)有相應的上調或下調.

2005年,Ding等[31]利用 BrdU標記 DNA,發現細胞被阻滯在 G2/M期.但是,當細胞暴露于低劑量的 CNTs時,細胞內與蛋白合成、轉運相關的基因表達降低,促 G1-S期轉換的基因表達也降低,細胞將被滯在 G1期.

2009年,Sargent等[32]報道 SWNTs能夠參入到有絲分裂紡錘體中,促使紡錘體分解,誘發細胞轉化為多倍體.

2.3 CNTs提高細胞內氧化應激水平

氧化應激指機體在遭受刺激時,體內高活性分子如活性氧自由基 (reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基 (reactive nitrogen species,RNS)產生過多,氧化程度超出細胞清除氧化物的能力,于是氧化系統和抗氧化系統失衡,導致細胞損傷.它通常被認為是納米顆粒導致細胞毒性的重要途徑[33].ROS是血管細胞增長的重要細胞內信號,與血管狀態 (如高血壓、動脈粥樣硬化)有關,在肺纖維化、癲癇、高血壓、動脈粥樣硬化、帕金森等疾病中均扮演重要角色.因而,在很多的 CNTs毒性試驗中,人們很自然地對CNTs引起細胞氧化應激水平進行了測定.

早在 2003年,Shvedova等[15]發現,在暴露于CNTs后,細胞內活性氧水平升高,細胞抗氧化能力降低,細胞內低分子量含巰基蛋白減少.CNTs引發的細胞內 ROS的提升,能夠進一步引起細胞內轉錄因子核因子 -κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表達的提高,并最終引起細胞死亡[34].不過,在他們的實驗中,所使用的 CNTs純度很低,鐵含量高達 30%,而鐵是已知的能強烈引起 ROS的物質.因而,他們推測氧化應激主要來源于生產 CNTs時引入的金屬催化劑.

2006年,Fenoglio等[35]利用純化后的 MWNTs,探討 CNTs與自由基的關系.他們通過NaOH和 SDS等的處理,將 MWNTs中的金屬含量控制在 1%以下.結果發現,CNTs不僅沒有引發自由基的產生,反而有很強的捕獲自由基的能力.這佐證了細胞中自由基來源于金屬雜質的說法.

Kagan等[36]探討了純化前 (w(Fe)=26%)和純化后 (w(Fe)=0.23%)的 SWNTs對RAW264.7細胞產生自由基的影響.在他們的實驗條件下,二者都沒有直接引起 RAW264.7細胞內自由基含量的升高.但是,對于已經被酵母聚糖 (zymosan)或十四烷酸乙酸佛波酯 (phorbol myristate acetate,PMA)刺激激活的 RAW264.7細胞,純化前和純化后的 SWNTs都能引起細胞內谷胱甘肽 (GSH)含量的降低,以及脂過氧化的提高.含有雜質較多的 SWNTs較純化后的 SWNTs能更顯著地改變兩個氧化應激指標.他們還研究了這兩種碳管對鼠上皮細胞 (JB6 P+)的影響[37].結果發現,在未純化的 SWNTs孵育過的細胞中檢測到了自由基信號和轉錄因子活化蛋白-1(activating protein-1,AP-1)表達量升高,而純化后的SWNTs孵育的細胞中則沒有.不過,在兩種碳管孵育過的細胞內,另一種通常在氧化應激中被激活的NF-κB表達量的提高程度卻非常相似.

2007年,Pulskamp等[38]探討了金屬雜質對細胞產生 ROS的影響.通過比較含催化劑少、純度高的酸處理過的 SWNTs與直接商業生產出的金屬含量較高的 SWNTs的細胞毒性,他們發現,在 100μg/mL的濃度下,經酸處理過且金屬含量較少的 SWNTs沒有引起細胞內 ROS的顯著提高,其他金屬量較多的CNTs都引起了 ROS的提高.

Pulskamp等[39]還發現,修飾前的 CNTs樣品中通常混雜的金屬雜質和不定形碳,都可能引起細胞內氧化應激水平的增高,但是,兩種雜質可能通過刺激不同的途徑引起氧化應激.他們發現,不定形碳雜質能夠在短短的 10 min內迅速引起細胞內自由基含量的升高,而金屬雜質只有經過較長時間的接觸(如 24 h),才能引起細胞內自由基含量的提高.

研究還發現,雖然除掉雜質能夠減弱 CNTs引起的氧化應激,但是并不能完全消除.也就是說,碳管本身可能也具有導致細胞產生氧化應激的能力.2009年,Choi等[40]在測定 SWNTs引起細胞內 ROS提高的實驗中,使用了更高的濃度 (500μg/mL)和更久的孵育時間(72 h),結果得到的 ROS響應非常明顯.更有意思的是,盡管以往的實驗中都推測,CNTs中含有的 Fe雜質對 CNTs產生氧化應激起著關鍵的作用,但是在該實驗中,SWNTs孵育過的細胞內ROS水平高于同等濃度氧化鐵納米粒子孵育過的細胞 (見圖3).圖中:LMH(layered metal hydroxide)是一種復合納米材料 (Mg0.68Al0.32(OH)2(CO3)0.16·0.1H2O,尺寸為 200 nm);氧化鐵和硅的尺寸分別為20～30 nm和約 14 nm;SWNTs直徑為1.2～1.5 nm,最大長度為 2.5μm.

圖3 CNTs孵育 A549細胞 72 h后 ROS的升高[40]Fig.3 CNTs induce the ROS generation in A549 cells after 72 h incubation[40]

Herzog等[41]的研究也認為,減少 CNTs外的金屬含量,能夠顯著降低碳管在細胞內產生活性氧的能力.但是,純化的 CNTs仍然具有一定的引起細胞內活性氧增高的能力,并且該能力與 CNTs在體系中的分散密切相關.也就是說,不僅是金屬催化劑,碳管的表面性質也是引發細胞內 ROS提升的原因.

2.4 CNTs促使細胞凋亡

凋亡,又稱程序化細胞死亡,是細胞主動實施的一種死亡形式和機制.細胞粘附能力的降低,細胞增殖受阻,細胞內氧化應激水平的提高,都可能引起細胞通過凋亡走向死亡.

2005年 ,Cui等[18]用 SWNTs處理 HEK293細胞,并利用形態學觀察、DNA Ladder和 PI單染等多種方法檢測細胞凋亡.結果發現,25μg/mL的SWNTs,經過 4 d的孵育能夠引發 43.5%的細胞發生凋亡.凋亡發生的程度與孵育時間和暴露劑量成正比.他們認為,凋亡的發生是由 CNTs改變細胞周期相關因子,以及細胞粘附相關因子引起的.

2005年 ,Ding等[31]利用 YO-PRO1/PI雙染的方法觀測 MWNTs導致的細胞壞死與凋亡.他們發現,MWNTs處理造成細胞出現凋亡和壞死,并且具有劑量依賴性.基因芯片分析結果顯示:經過 48 h的暴露,低劑量下 (0.06 mg/mL)MWNTs主要使得細胞活力降低;高劑量下 (0.6 mg/mL)MWNTs能引起大量的促進細胞凋亡和壞死的基因,如 TNF家族蛋白、BCL2L2、MCL1等表達量升高.

2006年,Bottini等[42]研究了 CNTs誘導 T細胞凋亡的效果,結果也顯示高劑量 (400μg/mL)的CNTs能引起嚴重的細胞凋亡 (見圖4).2009年,Choi等[40]、Ravichandran等[43]也分別在兩種肺上皮細胞A549和 LE中,觀察到了 CNTs引起的細胞凋亡.

圖4 CNTs引起 Jurkat細胞凋亡[42]Fig.4 CNTs induce apoptosis of human Jurkat cells[42]

Muller等[44]也報道了 MWNTs引起上皮細胞MCF-7的凋亡,他們還同時發現MWNTs能夠引起細胞染色體斷裂和形成細胞內的微核體.他們的結果在Lindberg等[45]和 Cveticanin等[46]的 DNA雙鏈的斷裂檢測和微核體的形成實驗中得到了進一步證實.

利用相似的實驗手段,一些文獻也報道了 CNTs不能引發細胞發生凋亡.De Nicola等[28]就認為CNTs僅影響細胞的增殖,不會讓細胞壞死和凋亡.Hirano等[47]報道 CNTs不能引起凋亡路徑上的Caspase 3和 PARP表達量提高.Tabet等[48]在研究CNTs對 A 549的細胞毒性時,用 DNA Ladder方法觀測細胞內 DNA的變化,結果發現細胞沒有發生凋亡的趨勢.但要注意的是,在這些工作中使用的 CNTs的濃度都低于 100μg/mL,相對于那些觀測到細胞凋亡的實驗來說劑量偏低,并且作用時間偏短.要判斷 CNTs是否能引起細胞發生凋亡,還要考慮體外實驗的暴露劑量是否遠高于最大的機體真實暴露劑量,而使結果失去真實性.總體來說,CNTs是否引起細胞發生凋亡或壞死有一定的劑量效應,低劑量的CNTs常顯示出較高的安全性,而高劑量的 CNTs則有可能引起細胞凋亡或壞死.

2.5 CNTs對細胞的其他影響

除了上述影響外,經過 CNTs暴露,細胞本身所具有的某些特性也有可能發生改變.2005年,Cui等[18]用 SWNTs處理 HEK293細胞 ,發現 SWNTs會逐漸被細胞分泌出的蛋白包裹,以起到與細胞分隔的效果,這是細胞自我保護的一種手段.經過電泳分析,發現這些蛋白是一組分子量在 20～30 kD的蛋白.Hirano等[47]否認MWNTs刺激巨噬細胞產生氧化應激的能力,他們認為 MWNTs表面能夠吸附和結合細胞表面的MARCO(macrophage recep tor w ith collagenous structure),促進了巨噬細胞對MWNTs的吞噬和消化,并相應地在巨噬細胞中體現出一定的細胞毒性.2005年,Jia等[49]研究了 CNTs對肺氣泡巨噬細胞 (alveolar macrophage,AM)的影響.他們發現,當 SWNTs濃度高于 0.38μg/cm2,MWNTs濃度高于 3.06μg/cm2時,AM的吞噬能力降低.另外,對于免疫細胞,CNTs通常能引起細胞的炎癥反應,如IL-8[50],TNF-α[51]分泌的增加等.但是 ,Herzog等[52]報道 SWNTs能夠抑制 A549細胞和 NHBE細胞 IL-8和 TNF-α的表達,尤其在二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (肺液中的成分,能夠提高 CNTs的分散性)和 TNF-α的刺激下,SWNTs抑制細胞因子產生的能力更加顯著.

3 影響 CNTs細胞毒性的因素

3.1 外在因素

3.1.1 實驗條件的影響

CNTs的劑量、接觸時間以及細胞系的選擇都會影響 CNTs毒性的大小.上文已經提到,CNTs的細胞毒性存在劑量效應.通常來講,CNTs在低濃度下有較高的安全性,在較高濃度下毒性較強.同時,CNTs的細胞毒性也存在時間效應.在 Cui等[18]的實驗中,相同劑量下,CNTs孵育細胞的時間越長,細胞的存活率越低.然而,在 Tutak等[27]的實驗中,相同劑量下,短時間的 CNTs孵育后 (24 h內),細胞有較多的死亡,隨著時間的延長,細胞增殖能力回復,細胞數目不斷增長.在 CNTs的細胞毒性研究中,劑量和時間兩個變量的影響也非線性,可能存在復雜的機制.在同一研究中,使用相同的 CNTs、相同的暴露劑量和時間,選擇的細胞系不同,得到的毒性數據也存在差別[16-17,29,53].因此,劑量、時間點、細胞系等實驗條件的選擇,對于檢測和評估 CNTs的細胞毒性至關重要.

3.1.2 雜質的影響

CNTs制備過程中引入的,經純化過程后殘留的金屬雜質、碳雜質,能夠引起細胞內 ROS升高,消耗細胞內還原性多肽和蛋白,引起細胞內 NF-κB表達的提高[33,38],增大 CNTs的細胞毒性[15,54-56].經過基本的純化步驟,少量被封裝在碳結構中的金屬,在細胞培養體系中仍有可能被釋放出來,并對其毒性產生重要影響[57].目前,CNTs的完全純化仍然是一個有待突破的課題[58].制備方法、純化步驟的不同,CNTs中雜質的組成、比例也存在差異,這使得雜質對 CNTs毒性的影響更為復雜.

3.1.3 純化方法和混酸處理的影響

未修飾 CNTs在制備與直接接觸細胞之間,還涉及純化步驟.純化過程是一個化學過程,往往涉及強酸回流、高溫加熱、超聲等操作.這些操作在除去金屬雜質的同時,不可避免地在 CNTs的表面,尤其是缺陷位置引入官能團.Bottini等[42]比較了純MWNTs和酸處理后的MWNTs對 T淋巴細胞系 Jurkat細胞的影響.結果發現,酸處理后的 MWNTs的細胞毒性顯著提高.Albini等[59]用硝硫混酸處理 SWNTs,得到的氧化 SWNTs有更強的細胞毒性.與之相對的是 Porter等[55]的實驗,他們也利用酸化后的分散性很好的SWNTs來檢驗 CNTs的毒性,并且利用 Raman技術確定了所用的 CNTs表面存在大量由于酸化而產生的官能團.但是,該實驗中使用的 CNTs并沒有顯示出細胞毒性.這些結果提示我們,雖然在純化過程中產生的官能團是少量和簡單的,但是,這一部分官能團的存在對 CNTs的分散性可能有較大的影響,在生物體系中可能影響其生物效應.3.1.4 細胞培養環境體系的影響

評價 CNTs的細胞毒性,需要考慮到 CNTs與培養基等復雜液體環境相混合的過程和影響.CNTs具有大的比表面積,可以吸附環境體系中的蛋白質、芳香類分子.在自身表面性質變化的同時,其毒性也受到影響.CNTs還受到生物體系中金屬離子 (緩沖體系)的影響,其分散性能發生顯著地變化.常用的培養基通常加入血清為細胞正常生長提供營養,加入酚紅指示培養基的 pH值變化.研究表明,CNTs可以吸附酚紅[60],改變其細胞毒性.CNTs在無血清體系中的細胞毒性較有血清體系顯著偏高[61-62],血清能夠包裹 CNTs,降低 CNTs在細胞內產生 ROS的能力[41].Casey等[30]研究發現 CNTs之所以會顯現出細胞毒性,是因為血清中蛋白被 CNTs所吸附,相當于消耗了培養基中的營養,使所孵育的細胞缺乏營養而活力低于空白組,產生假陽性.他們將 CNTs在培養基中孵育一定時間,過濾培養基獲得不含有CNTs的培養基,用此培養基培養的細胞的細胞活力顯著降低.但 Geys等[63]也做了相似的實驗,卻發現血清的存在與否對 CNTs的毒性沒有產生影響.綜合上述工作,CNTs的吸附性能可能影響其細胞毒性,但目前對于培養基中究竟何種組分被 CNTs吸附帶來的影響更為關鍵,并產生了怎樣的影響還有待于進一步細致、深入地研究.

3.1.5 實驗方法的影響

要檢驗 CNTs細胞毒性各個方面的影響,需要使用多種實驗方法.細胞毒性一個方面的變化,可以選擇的檢測方法也不唯一,而利用不同的方法檢驗同一指標的變化也有可能存在差異.例如,細胞存活率檢測方法包括臺盼蘭染色直接計數法、MTT染色測紫外吸收法、MTT的改進方法WST和 MTS法、間接指示細胞死亡率的乳酸脫氫酶 (LDH)露出率法、用流式細胞儀計數細胞存活率的碘化丙啶 (PI)法以及Bradford測蛋白濃度法等.這些方法主要是利用各種染料,與細胞內恒定含量的組分結合,或被與活細胞數目相關的酶催化轉化,生成有特定吸光或熒光的物質,通過檢測光信號的變化來檢測細胞活力的變化.每種檢測方法都是從各自的角度來確定細胞毒性,因此,對于同樣的 CNTs,不同方法檢測得到的毒性結果可能有所不同[64].

CNTs對染料的吸附也有可能干擾通過使用這些染料得到結果.研究發現,在MTT方法測定細胞活力的實驗中,雖然 CNTs并不干擾甲臜 (MTT被線粒體內酶催化氧化生成的產物)在細胞內的形成,但是,吞噬到細胞中的 CNTs能夠吸附生成的甲臜.而通常所使用的用于溶解甲臜的 DMSO或 SDS的酸溶液無法將吸附在 CNTs上的那部分溶解下來 (見圖5),因而,實驗上觀測到的吸光度比實際產生的甲臜完全溶解后的溶液的吸光度低,造成假陽性[20,65-66].

圖5 利用M TT方法檢測 CNTs細胞毒性時假陽性產生的機制[65]Fig.5 Proposed m echan ism for the false positive cytotox icity of CNTs using M TT assay[65]

不使用染料評價 CNTs細胞毒性的方法能夠避免染料與 CNTs相互作用帶來的影響.克隆形成法是一種不涉及染料的細胞毒性檢測方法,該方法最初主要用于放射線毒性的檢查 (普通染料可能被輻射破壞),目前也被用于 CNTs的毒性研究中[29-30,67].該方法通過稀釋并得到單分散的細胞,在培養皿中經過 10 d的培養,使每個能正常繁殖的細胞在原位擴增為肉眼可以觀察的集落 (見圖6).圖中,P90為 Printex炭黑,ArcD為電弧法生產的CNTs,Hipco為 Hipco 生產的 CNTs[29].集落數量的減少表示細胞存活率的降低,集落的大小則可反映增殖能力的變化.Herzog等[28]的結果和 W?rle-Knirsch等[20]、Casey等[30]得到的結果一致,即 CNTs沒有明顯地使細胞存活率降低.該方法的最大好處就是不受任何染料的影響,缺點是工作量較大,比較費時.該方法可以作為標準方法用來參比使用染料方法的準確性.

綜上,CNTs細胞毒性的結論應該是建立在綜合多種方法實驗結果的基礎上,這樣的結論也才是可靠的.

圖6 CNTs對 A549細胞集落形成的影響[29]Fig.6 Effect of CNTs exposure on colony formation of A549 cells[29]

圖7 長度對 CNTs細胞毒性的影響[68]Fig.7 Influence of the length on the cytotoxic ity of CNTs[68]

3.2 內在因素

3.2.1 長度的影響

Sato等[51]研究了平均長度為 220和 825 nm的兩種MWNTs對人急性白血病細胞系 HTP-1的細胞毒性.他們發現,長MWNTs引起細胞內 TNF-α表達量升高的幅度比短 MWNTs大.他們推測:短MWNTs更容易被細胞吞噬和包裹,因而引起的免疫反應更小;長 CNTs更容易穿破細胞,造成細胞損傷(見圖7)[68].

在 Shi等[69]的研究中,長 SWNTs和短 SWNTs都沒有顯示出明顯的細胞毒性.在 Simon-Deckers等[65]的實驗中,長的和短的MWNTs都顯示了較強的細胞毒性,但是二者之間沒有顯著性差別.

可以看到,長度究竟怎樣影響CNTs的細胞毒性,目前還存在著爭議,值得進行更深入研究.

3.2.2 聚集程度的影響

碳納米管的聚集程度會影響到 CNTs的形態、表面積等,對其細胞毒性影響顯著.Belyanskaya等[53]在研究 SWNTs對神經元細胞和膠質細胞的毒性時發現,分散性好的 SWNTs對兩種細胞均顯現了更強的毒性.他們推測,這是由于分散性好的 CNTs表面積更大,和細胞的作用更強.Raja等[70]通過過濾的方法,將 CNTs中大的聚集體濾掉,發現 CNTs表現出的毒性有所降低,但降低程度不明顯.然而,支持 CNTs的毒性來源于其纖維狀結構的研究者卻發現,分散性差的 CNTs由于具有較高的剛性而顯示出更大的細胞毒性[71].3.2.3 管壁層數的影響

盡管沒有能夠得出確切結論的報道,SWNTs的細胞毒性通常大于 MWNTs[21].在 Jia等[49]的研究中,SWNTs在 0.38μg/cm2濃度下就顯現出細胞毒性,而MWNTs在 3.06μg/cm2才開始引起細胞活力的損失.SWNTs有較大的比表面積和較強的管間作用力,容易形成納米管束,而MWNTs管壁通常存在更多的缺陷和官能團.雖然同為 CNTs材料,但二者無論在毒性,還是在毒性產生的機制上都存在差異.

綜上所述,CNTs的細胞毒性是一個多維的課題.要判斷 CNTs的細胞毒性,搞清楚 CNTs的毒性的機制,還需要很多實驗數據的積累和系統分析.

4 總結與展望

作為納米材料中的明星成員,碳納米管的細胞毒性受到人們的關注.隨著大量相關工作報道,我們也從中獲得關于 CNTs細胞效應的諸多信息.然而,縱覽 CNTs細胞毒性的研究文獻,會發現即使用相同的細胞生物學研究手段,就某一項指標在結論上卻常常出現大相徑庭的結果.產生這些矛盾的影響因素很多,這些矛盾也為今后 CNTs細胞毒性的研究指明方向.

首先,CNTs的多樣性給 CNTs的毒性評價帶來困難.CNTs的制備方法、純化手段多種多樣,使得同實驗室不同批次得到的 CNTs在長度、管徑、純度方面都存在著不同[28].早期用于 CNTs毒性評價的CNTs樣品往往金屬雜質含量偏高,CNTs的毒性也較高[15].隨著純化和分離手段的進步,人們逐漸發覺 CNTs的純度[28]、長度[51]、聚集程度[70,72]都會影響 CNTs的細胞毒性[73-74].同時,關于這些因素是否真的會影響 CNTs的細胞毒性還存在爭議[66].CNTs的物化參量眾多,在比較 CNTs的細胞毒性時,這個多維的體系需要保持單一的變量,所得到的結果才有意義,但目前還很難做到.而且,即使是使用同一種 CNTs,在同樣實驗條件下,不同的細胞對 CNTs的反應也可能存在差異[29,70,75].這些變量對 CNTs細胞毒性的影響需要系統研究.要使不同的實驗室所得數據具有可比性,最有效的方法就是能夠建立一個公認的標準品.在此基礎上進行的研究結果,才會有更廣泛的應用意義.

其次,傳統的細胞生物學方法不一定適用于CNTs細胞毒性研究.CNTs作為一種高比表面積、高吸附能力的外源物質被引入細胞培養體系,并可能被細胞吞噬.而表征細胞活性或機能的參數很多是通過特定分子發出的吸光或熒光信號給出的.CNTs是否會對這些表征產生影響正逐漸引起人們的關注,已經有一些先期的工作發表.目前比較保守的做法是針對每一個指標盡量用多種方法,從多個角度相互佐證,以提高結果的可靠性.當然,在這些方法比較的過程中,必須建立標準和可靠的用于 CNTs甚至所有納米材料細胞毒性研究的方法.發展 CNTs細胞毒性標準檢測方法是最終獲得 CNTs真實毒性的基礎.

最后,納米材料的濃度界定模糊.許多納米材料,包括未修飾 CNTs,在水溶液中溶解性低,多以固體形式沉積于細胞表面,而不是懸浮于培養基中.利用單位體積內的 CNTs數量、單位細胞的 CNTs數量、培養皿單位面積的 CNTs數量,作為 CNTs單位的文獻都已報道,因此,確立合適的 CNTs劑量描述單位,對納米材料的毒性研究意義深遠.

總體來說,對于 CNTs細胞毒性的研究,要獲得真實可信的結果,需要標準可信的檢測方法,需要標準的 CNTs樣品,需要系統研究各個影響因素造成的細胞應答.

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(編輯:劉志強)

Cytotoxicity of Pr istine Carbon Nanotubes:M echan ism and Influencing Factor s

L IU Yuan-fang1,2, L IU Jia-hui1,2, WANGHai-fang1
(1.Institute of Nanochemistry and Nanobiology,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China;2.College of Chemistry and Molecule Engineering,Peking University,Beijing 100871,China)

O 613.71

A

1007-2861(2010)05-0447-13

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.002

2010-06-08

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(2006CB705604)

劉元方 (1931～),男,教授,中國科學院院士,博士生導師,研究方向為納米生物學.E-mail:yliu@pku.edu.cn