犢牛源乳酸菌的篩選及抑菌性能研究

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 郭奇苑 孫 文 徐基利 許 麗

動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系從多方面影響機(jī)體微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定和動(dòng)物健康。然而由于動(dòng)物種類和環(huán)境的不同，定植腸道細(xì)菌的種類和數(shù)量相差很大，定植的能力也不盡相同（Chiquette，2009）。理想的益生素菌種最好來(lái)自同源動(dòng)物的腸道。對(duì)反芻動(dòng)物的不同生長(zhǎng)階段使用不同的益生素，并充分考慮其使用目的，才能以最經(jīng)濟(jì)的方式達(dá)到最理想的效果。幼犢的腹瀉是由寄生在腸道中能產(chǎn)生腸毒素的細(xì)菌引起的，微生態(tài)制劑中的益生菌可抑制致病菌在腸道的定植，同時(shí)可產(chǎn)生對(duì)致病菌有抑制作用的生物活性物質(zhì)。本試驗(yàn)選取15日齡健康犢牛，對(duì)腸道內(nèi)容物以及腸黏膜上的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選耐受性和抑菌效果良好的菌株，從而為開(kāi)發(fā)促進(jìn)犢牛生長(zhǎng)、防治犢牛腹瀉性疾病的微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 選擇15日齡未飼用抗生素的健康荷斯坦?fàn)倥７叛涝住＝Y(jié)扎截取十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸腸段，冰凍保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 質(zhì)控菌株 大腸桿菌（Escherichia coli），致病性大腸桿菌（C83092）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS液體和固體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑 牛膽鹽 （北京奧博星公司）、胃蛋白酶（Sigma）、3%過(guò)氧化氫、革蘭氏染液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與命名 分別取不同腸段食糜0.5 g于4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中，連續(xù)進(jìn)行倍比梯度稀釋，吸取10-6、10-7梯度稀釋液0.1 mL于MRS平板上涂布；取健康犢牛腸道黏膜4 cm2（十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸），用無(wú)菌生理鹽水沖洗黏膜至無(wú)可見(jiàn)食糜，用無(wú)菌棉棒擦拭腸黏膜上皮，劃線涂于MRS平板上。將上述平板放置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱（5%CO2）培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌株，并進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡檢，選擇革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶接觸陰性且無(wú)芽孢的菌株為后備菌株貯存?zhèn)溆谩?/p>

菌株的命名根據(jù)腸道來(lái)源不同，以拼音首字母代表，如分離于回腸食糜的第一株命名為H1，分離于空腸壁第二株則為KB2。

1.2.2 耐酸性試驗(yàn) 把上述分離到的菌株活化，接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24 h后，將液體培養(yǎng)物按5%（V/V）的接種量接入pH值2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，同時(shí)以pH值6.25的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照。置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 h，而后取0.1 mL菌懸液，進(jìn)行平皿菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算酸處理過(guò)的菌株存活率：a1/a0×100%，a1： 各處理組 2 h 后的每毫升活菌數(shù)（CFU/mL），a0：對(duì)照組每毫升活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.2.3 耐膽鹽試驗(yàn) 在MRS液體培養(yǎng)基分別添加 0%、0.1%、0.2%、0.3%（m/V）的牛膽鹽，接種5%（V/V）已活化的菌種，方法同上，處理2 h后計(jì)算菌株存活率。

1.2.4 胃蛋白酶耐受性試驗(yàn) 以液體MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用體積分?jǐn)?shù)37%的鹽酸將其調(diào)至pH=3.0，再加入 5 mg/mL 胃蛋白酶（3000 NF U/mg）作為模擬胃液，以不加胃蛋白酶且pH值6.25的MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，將試驗(yàn)菌株的液體培養(yǎng)物按5%（V/V）的接種量接入，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)2 h取樣測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.5 抑菌性試驗(yàn) 均勻涂布受試大腸桿菌和大腸桿菌C83092懸液于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用無(wú)菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯于培養(yǎng)基上。在牛津杯中加200 μL的乳酸菌液體培養(yǎng)物，每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù)。加完樣后置4℃冰箱靜置固定30 min，然后放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離 本試驗(yàn)從15日齡犢牛不同部位腸道食糜和腸道黏膜共分離出35株無(wú)芽孢乳酸菌，其中31株為革蘭氏染色陽(yáng)性菌。通過(guò)鏡檢，有12株為球菌，其中10株來(lái)自腸道食糜，2株來(lái)自腸道壁。剩余19株桿菌中有9株來(lái)自腸道食糜，10株來(lái)自腸道壁。在MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)多呈現(xiàn)乳白色，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊。

2.2 耐酸性試驗(yàn) 由表 1可以看出，SB1、SB2、M5都表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，酸處理2 h后存活率仍達(dá)到30%以上；MB3、M7、Z4對(duì)酸也有一定的耐受性，存活率均可超過(guò)20%；而K1、ZB1、HB3在此條件下較為敏感，存活率分別為14.22%、8.74%和7.16%；其余菌株生長(zhǎng)則受到強(qiáng)烈的抑制，存活率均在5%以下。十二指腸壁分離出的兩株乳酸菌與其他部位相比耐酸特性較好，而且強(qiáng)于同腸道食糜中分離到的。最終以存活率5%為界限，選定SB1、SB2等9株菌進(jìn)行下一步的篩選。

表1 pH=2條件下31株乳酸菌耐酸存活率

2.3 耐膽鹽試驗(yàn) 由表2可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度的牛膽鹽對(duì)試驗(yàn)菌均有抑制作用，質(zhì)量濃度增加抑制作用也隨之增強(qiáng)，不同菌株對(duì)膽鹽的耐受性表現(xiàn)出一定的差異。在膽鹽濃度為0.1%，處理2 h后，M7的耐受性最強(qiáng)，達(dá)到了70.31%。其他菌株的耐膽鹽性從高到低依次為 K1、SB2、M5、SB1、HB3、Z4，存活率都超過(guò)了 25%；而 ZB1和 MB3對(duì)此濃度膽鹽則較敏感，存活率在20%以下。當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.2%時(shí)，各菌株存活率迅速下降，膽鹽的抑制作用明顯，存活率最高的SB2僅為2.25%，其他均未超過(guò)1%。膽鹽濃度上升至0.3%時(shí)，牛膽鹽對(duì)各菌株表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，存活率均未達(dá)到0.5%。

表2 9株菌在不同膽鹽濃度中的存活率 %

2.4 胃蛋白酶耐受性試驗(yàn) 由表3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，各菌株的生長(zhǎng)都受到胃蛋白酶的抑制，處理2 h后活菌數(shù)均有所減少。Z4耐受性較強(qiáng)，在人工胃液中保持2 h后，存活率可以達(dá)到79.14%。M5與M7經(jīng)處理后的活菌數(shù)分別為4.83×108CFU/mL 和 4.45×108CFU/mL， 存活率也在50%以上。SB1、K1、MB3的存活率在30.90%～38.79%。菌株SB2、HB3、ZB1的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，對(duì)胃蛋白酶的耐受力相對(duì)較差，存活率不到20%。綜合以上耐鹽及耐酶結(jié)果，菌株M5、M7、SB1和Z4表現(xiàn)出良好的耐受性。

表3 人工胃液處理對(duì)9株菌活菌數(shù)及存活率的影響

2.5 抑菌性試驗(yàn) 由表4可以看出，4株乳酸菌全液對(duì)兩株大腸桿菌指示菌都有較強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)弱毒性大腸桿菌的抑制作用要優(yōu)于普通埃希氏大腸桿菌。Z4對(duì)弱毒性大腸桿菌C83092的抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑可以達(dá)到21.02 mm；M7、M5、SB1 的抑菌直徑在 19.48 ～20.30 mm，但4株菌的抑菌效果差異不顯著（P>0.05）。乳酸菌全液對(duì)埃希氏大腸桿菌的抑菌圈在16.42～16.94 mm，4株菌的抑菌效果差異不顯著（P>0.05）。

表4 4株乳酸菌全液對(duì)大腸桿菌的抑制作用

3 討論

3.1 菌株的分離 益生菌菌株定植的宿主特異性直接影響到益生菌制劑的應(yīng)用效果，因而菌種的分離選擇必須注意到宿主特異性問(wèn)題 （趙瑞香等，2002），理想的益生素菌種最好來(lái)自同源動(dòng)物的腸道。胃腸道菌群是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成，與宿主保持相對(duì)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，對(duì)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗疾病具有重要意義（孫志洪等，2007）。嗜酸性乳酸桿菌可降低腸道中大腸桿菌的數(shù)量。在這方面，從犢牛腸道中分離出來(lái)的嗜酸性乳酸桿菌的作用效果要好于從仔豬腸道中分離出來(lái)的（Wallace 和 Newbold，1992）。 其次許多從雞分離的乳酸桿菌只對(duì)雞小腸黏膜上皮細(xì)胞有黏附力，而對(duì)大鼠和豬等則沒(méi)有黏附力，同樣從大豬上分離的乳酸桿菌對(duì)小豬的腸黏膜上皮細(xì)胞黏附力較差（黃滄海等，2004）。 另?yè)?jù) Klaenhammer（1982）報(bào)道，形成光滑菌落的乳桿菌生長(zhǎng)速度快，在冷凍和干燥過(guò)程中存活率高，對(duì)膽鹽的耐受力也優(yōu)于形成粗糙菌落的菌株。

3.2 酸耐受性 新生犢牛的胃腸道環(huán)境類似于單胃哺乳動(dòng)物，而且尚未完全發(fā)育，幼齡動(dòng)物胃腸道內(nèi)的pH值一般在3～4。王傳彬等（1997）研究結(jié)果表明，動(dòng)物源乳桿菌對(duì)pH 2.5肉湯處理很敏感，而在pH 3.0肉湯中保溫2 h，存活率達(dá)70%以上。劉虹等（2006）對(duì)分離自肉雞腸道3株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌研究，pH值為2時(shí)接種3 h有一株仍能檢測(cè)到活菌數(shù)，但都對(duì)pH值為2.0的酸性環(huán)境非常敏感，同時(shí)活菌數(shù)不超過(guò)107CFU/mL。

3.3 膽鹽耐受性 動(dòng)物腸道內(nèi)膽汁濃度是不斷變化的，因而很難預(yù)測(cè)其在某一時(shí)間段內(nèi)的濃度，但總的來(lái)說(shuō)，小腸中膽鹽含量通常在0.03%～0.3%。Gilliland等（1984）報(bào)道，從犢牛分離的7株嗜酸乳桿菌中的3株菌對(duì)0.3%的膽鹽耐受性較好。李少英（2008）報(bào)道，從犢牛糞便中分離出的乳桿菌和雙歧桿菌能在0.1%的膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，有的存活率可達(dá)到80%以上，在膽鹽濃度為0.2%的培養(yǎng)基中，菌株的生長(zhǎng)作用受到抑制，而且隨著膽鹽的添加，抑制菌株生長(zhǎng)的作用明顯加強(qiáng)。吳惠芬（2003）選用從仔豬腸道食糜分離到的5株乳酸菌中產(chǎn)酸能力、抑菌能力均較強(qiáng)的2株，在0.1%膽鹽條件下，處理2 h后存活率分別為37%和36.23%；在0.2%濃度下，存活率為0.24%和0.005%；而在0.3%濃度時(shí)，存活率均不超過(guò)0.01%，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。

3.4 胃蛋白酶耐受性 江志杰等（2005）選擇雙歧桿菌，在含5 mg/mL胃蛋白酶的PBS培養(yǎng)基（pH=3）作用120 min后，有3株菌其活菌數(shù)均高達(dá)108CFU/mL，存活率在80%以上，其余3株活菌數(shù)則小于108CFU/mL。對(duì)照本試驗(yàn)結(jié)果，從活菌數(shù)上來(lái)看，這9株菌的耐消化道能力與上述菌相比更有優(yōu)勢(shì)，很夠很好地抵抗酶的水解作用。

3.5 抑菌性試驗(yàn) 通過(guò)耐消化道環(huán)境的篩選，結(jié)合存活率和活菌數(shù)，本試驗(yàn)篩選得到的4株乳酸菌對(duì)大腸桿菌均有明顯的抑制作用。劉文華等（2008）研究乳酸菌對(duì)大腸桿菌形成的抑菌圈直徑為16 mm，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。張素輝等（2007）試驗(yàn)表明，從仔豬糞便分離到的乳酸菌對(duì)大腸桿菌有較明顯的抑制作用，溫建新等（2008）對(duì)附著在雞盲腸上的乳酸菌分離，通過(guò)抑菌試驗(yàn)，對(duì)禽致病性大腸桿菌表現(xiàn)出一定的拮抗作用。一般認(rèn)為乳酸菌抗菌作用主要是通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸、H2O2以及細(xì)菌素等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)。

4 小結(jié)

M5、M7、SB1和Z4對(duì)鹽酸、牛膽鹽及胃蛋白酶的綜合耐受能力較好，在pH 2.0作用2 h后存活率分別為 39.24% 、28.08%、44.20%、23.28%；在含0.1%牛膽鹽MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2 h后存活率依次為 44.18%、70.31%、32.92%、29.86%；它們對(duì)胃蛋白酶也有很好的耐受能力，處理后存活率均超過(guò)30%，活菌數(shù)可達(dá)到108CFU/mL以上。從耐受性的綜合評(píng)定上看，分離于盲腸食糜的乳酸菌要優(yōu)于其他腸段分離的，而且也好于分離自同腸段腸道壁的。4株菌對(duì)弱毒性大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于普通大腸桿菌，抑菌直徑在16～21 mm。

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