甘草總黃酮和總皂苷成分的提取工藝及其含量分析△

黃明進，王文全，2*，沈壽茂

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102）

工藝研究

甘草總黃酮和總皂苷成分的提取工藝及其含量分析△

黃明進1，王文全1，2*，沈壽茂1

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102）

目的：優化甘草中總黃酮和總皂苷成分的提取工藝，并比較在不同品種和不同產地野生甘草藥材中的含量差異。方法：紫外分光光度計測定甘草總黃酮和總皂苷的含量，采用正交試驗法，考察乙醇濃度、固液比、氨水濃度及超聲溫度對其提取率的影響，優選出能同時提取兩類成分的合適工藝。結果：最佳提取工藝為乙醇濃度80%，固液比1∶20，氨水濃度0.3%及超聲溫度40℃；不同來源甘草藥材的總黃酮和總皂苷含量差異較大。結論：優選的條件可靠，重現性好，適合甘草總黃酮和總皂苷的同時提取；測定甘草總黃酮和總皂苷含量能有效評價甘草藥材質量。

甘草；總黃酮；總皂苷；正交試驗；含量測定

甘草是常用中藥材，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功能［1］，在醫療、食品、化妝品等行業中的應用廣泛。甘草黃酮和皂苷是基本結構不同的兩類化合物，也是甘草具有多種藥理作用的物質基礎，在甘草藥材中的含量較高，但在不同品種、不同產地甘草藥材中的含量差異較大，以往測定甘草總黃酮和總皂苷含量常以不同的提取分離方法分別進行樣品處理，操作過程復雜，耗時較長［2，3］。本實驗采用正交試驗法，以甘草中總黃酮和總皂苷的含量為指標，考察不同乙醇濃度、固液比、氨水濃度及超聲溫度對其提取率的影響，優選出最佳提取工藝，使之最大限度提取完全，同時，還測定分析了兩類成分在不同來源野生甘草藥材中的含量差異。

1 材料

1.1 儀器

電子分析天平（Sartorius BS110S萬分之一，BP211D十萬分之一）；KQ500DE型數控超聲波清洗器；Hitachi U-2000型紫外分光光度計等。

1.2 試藥

甘草酸（中國藥品生物制品檢定所，批號110731），甘草苷（上海康九化工有限公司，批號061009）；無水乙醇、氨水、氫氧化鉀、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為分析純。

不同品種和不同產地野生甘草藥材，甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.采集自西北地區（新疆、甘肅），中西部地區（內蒙古、寧夏、陜西），東北地區（吉林、黑龍江）等地，每區取樣5份；在新疆采集甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草Glycyrrhiza glabraL.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.各7份。以上藥材均由北京中醫藥大學中藥學院王文全教授鑒定。

2 方法

2.1 甘草總黃酮和總皂苷的含量測定

方法［4，5］，對甘草總黃酮和總皂苷的含量進行測定。

2.1.1 對照品溶液的配制 甘草苷儲備液：精密稱取甘草苷對照品4.65mg于10mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得0.465mg·mL－1的甘草苷對照品儲備液。

甘草酸儲備液：精密稱取甘草酸對照品15.97mg于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，即得1.597mg·mL－1的甘草酸儲備液。

2.1.2 標準曲線的制備 黃酮標準曲線：精密吸取甘草苷儲備液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL依次置于10mL的容量瓶中，各加入70%甲醇溶液1mL搖勻后，再加10%NaOH 2.5mL顯色，10min后用70%甲醇溶液定容至刻度，在λ＝410nm下分別測定吸光度值，并以甘草苷質量（mg）為自變量，吸光度為因變量，計算線性方程。

皂苷標準曲線：精密吸取甘草酸儲備液0.02，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25mL于6個5mL的容量瓶中，揮干溶劑，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.25mL，搖勻，加0.8mL高氯酸，搖勻，在55℃水浴反應20min，取出自來水冷至室溫，定容至刻度，用不含儲備液的溶劑作為空白，在λ＝589nm下測定吸光度，并以甘草酸質量（mg）為自變量，吸光度為因變量，計算線性方程。

2.2 正交試驗因素與水平

2.2.1 提取方法選擇 提取甘草藥材中的成分常有浸漬法、水煎煮法、回流法、超聲波萃取法等［6］，這些方法中，超聲波萃取法快速、方便、操作簡單，在實驗室中大都采用此方法對樣品進行處理。因此，本實驗采用超聲法進行甘草成分的提取。

2.2.2 影響因素及水平選擇 影響萃取效率的因素主要有溶媒濃度、用量、超聲溫度和強度等，結合文獻報道［7］，本實驗將溶劑濃度、固液比、加入氨水量、超聲溫度作為考察對象，并分別設3個水平，即4因素3水平，見表1。

表1 甘草總黃酮和總皂苷成分提取工藝因素水平表

2.3 試驗方案與指標測定

根據選擇的因素水平，按L9（34）正交試驗表進行試驗安排，共有9組試驗。按照試驗號對應的提取條件，分別稱取甘草粉末（20目）0.2g于25mL的容量瓶中進行提取試驗，每組重復3次，用繪制標準曲線下的方法分別測定其總黃酮和總皂苷的含量。

2.4 不同甘草藥材總黃酮和總皂苷含量比較

根據優化的提取條件進行樣品前處理，并比較不同品種、不同產地甘草藥材中總黃酮和總皂苷的含量差異。

2.5 數據處理

用Excel、SPSS進行數據計算和方差分析。

3 結果與分析

3.1 標準曲線

3.1.1 黃酮標準曲線 測定結果計算后得回歸方程Y＝2.156 8X＋0.007 3，r＝0.999 7，線性范圍0.023～0.372mg，極差為0.349mg，符合線性要求，可用于樣品總黃酮含量計算。

3.1.2 皂苷標準曲線 測定結果計算后得回歸方程Y＝3.045 3X－0.038 6，r＝0.999 5，線性范圍0.032～0.399mg，極差為0.367mg，符合線性要求，可用于樣品總皂苷含量計算。

3.2 正交試驗結果分析

對9組試驗測得的甘草總黃酮和總皂苷含量進行方差分析，篩選最佳工藝條件，結果見表2～4。

表2 甘草總黃酮和總皂苷成分提取工藝正交試驗表

表3 總黃酮方差分析表

表4 總皂苷方差分析表

以甘草中總黃酮含量為指標，對數據進行方差分析，可得出各因素重要程度依次為B＞A＞D＞C，即固液比＞乙醇濃度＞超聲溫度＞氨水濃度，提取甘草中總黃酮的最優條件為A3B3C3D2。以甘草中總皂苷的含量為指標分析表明，最重要的因素是B，影響因素大小依次為B＞C＞D＞A，即固液比＞氨水含量＞超聲溫度＞乙醇濃度，提取總皂苷的最優條件為A3B3C3D3。

分析結果顯示，各因素對兩成分提取率的影響主次不同，除固液比外，黃酮成分提取率主要受乙醇濃度的影響較大，氨水濃度在因素中的影響最小，但皂苷則受氨水濃度的影響較大，而乙醇濃度對其提取率的影響較小。

9組試驗總黃酮和總皂苷含量比較見圖1。從圖1還可直觀地看出，在不同提取條件下，甘草總黃酮和總皂苷的含量差異較明顯，在試驗3條件下，即A1B3C3D3，甘草皂苷的提取率達到最高，但甘草黃酮提取率不高，這是因受乙醇濃度的影響較大，高濃度的乙醇才有利于黃酮成分的溶出，綜合兩指標，最佳工藝條件為A3B3C3D3，與第9次試驗的A3B3C2D1接近，且從圖1中可看出，該工藝條件下，提取率幾乎達到最大值，若適當增加固液比，甘草總黃酮和總皂苷的同時提取，完全可以兼顧。

圖1 9組試驗總黃酮和總皂苷含量比較

A3B3C3D3不在安排的9組試驗中，稱取同批試驗樣品，進行驗證實驗，總黃酮和總皂苷的含量分別為50.19，59.78mg·g－1，驗證結果與正交試驗結果吻合，說明工藝穩定可行，可用于同時測定甘草總黃酮和總皂苷含量時的樣品前處理。

3.3 不同品種和不同產地甘草藥材總黃酮和總皂苷含量比較

不同品種甘草藥材總黃酮含量測定結果見表5。

從表5可以看出，采集的7份不同品種甘草藥材總黃酮含量差異較大，方差分析表明其存在顯著差異，P＜0.05，以甘草的含量最低，脹果甘草含量最高。

不同產地甘草總黃酮和總皂苷含量測定結果見表6。

表5 不同品種甘草藥材總黃酮含量

表6 不同產地甘草藥材總黃酮和總皂苷含量

從表6數據分析可知，西北甘草總黃酮含量較低，而總皂苷含量卻較高，與中西部地區比較有顯著差異（P＜0.05）；但因樣本數量有限，分析結果僅供參考。

4 結論與討論

甘草黃酮和皂苷成分是甘草藥材中活性較強的兩類化合物［8］，因基本結構不同，其理化性質各異，在生產過程中分別進行提取分離，則選擇性較好，但操作較繁瑣，需要的試劑和材料較多，往往造成資源的浪費，若采取同時從藥材中提取分離的方法將會大大降低成本。鑒于此，本試驗優化了同時提取的工藝條件，為進一步的分離及其含量測定提供參考。

甘草藥材來源復雜［9］，質量參差不齊，這給處方用藥的質量控制帶來了困難，要保證處方用藥的安全有效，需要找到能代表全面作用的靈敏指標來控制，本試驗比較了甘草總黃酮和總皂苷成分在不同品種和不同產地甘草藥材中的含量，結果有效反映了不同來源甘草藥材之間的質量差異，檢測方法能很好地用于甘草藥材的質量評價。

研究甘草總黃酮和總皂苷成分的提取工藝及其在不同來源甘草藥材中的含量差異，對合理有效地利用甘草，保證處方用藥的安全有效性等具有重要意義。

參考文獻

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：化學工業出版社，2005：59.

［2］賀小賢，陳合.甘草酸提取工藝研究［J］.陜西科技大學學報，2004，22（6）：26-29.

［3］張夢軍，金建鋒，李伯玉.微波輔助提取甘草黃酮的研究［J］.中成藥，2002，24（5）：334-336.

［4］馮薇，王文全，趙平然.甘草總黃酮含量測定方法研究［J］.時珍國醫國藥，2007，18（11）：2608-2610.

［5］蘭霞，王洪新.比色法測定甘草中總皂苷含量［J］.時珍國醫國藥，2007，18（4）：886-887.

［6］匡海學.中藥化學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2003：21-23.

［7］李炳奇，汪河濱，李學禹，等.超聲法聯合提取甘草黃酮和甘草酸的研究［J］.山東中醫雜志，2005，24（1）：38-40.

［8］高雪巖，王文全，魏勝利.甘草及其活性成分的藥理活性研究進展［J］.中國中藥雜志，2009，34（21）：25-31.

［9］王文全，吳慶豐.我國的甘草資源與甘草栽培技術［J］.中藥研究與信息，2001，3（12）：18-20.

Study on the Extraction and Contents for Total Flavones and Saponins from Radix et Rhizoma Glycyrrhizae

Huang Mingjin1，Wang Wenquan1，2，Shen Shoumao1
（1.Chinese Pharmacy college，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100102，China；2.The Engineering Research Center for Chinese Medicine Standardized Production of Educational Ministry，Beijing100102，China）

Objective：To optimize the extraction technology of total flavones and saponins from radix et rhizoma glycyrrhizae，and compare their difference in contents.MethodsThe total contents of flavonoids and saponins are determined by UV spectrophotometer，and orthogonal experiment is used for optimizing the extraction technology.ResultsThe optimal extraction technology should be A3B3C3D3，and there are obvious differences in the total contents of flavonoids and saponins among various areas.ConclusionThe extraction method is simple and realizable，and it is feasible to determine the contents of total flavonoids and saponins to control the herbs quality.

Radix et rhizoma glycyrrhizae；Flavonoids；Saponins；Rthogonal experiment；Contents

國家自然科學基金項目（30572328）；高等學校博士點科研基金項目（20050026006）

*王文全，E-mail：wwq57＠126.com

2010-03-09）